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10月10-15日我校細胞動力學(xué)教育部重點實驗室張凱銘團隊在解析Lon蛋白酶的完整三維結(jié)構(gòu)并揭示其底物識別與轉(zhuǎn)移的分子機制取得重要進展，與臺灣中央研究院張崇毅團隊在期刊JBC和Sciences Advances合作連續(xù)發(fā)表論文。

Lon AAA+蛋白酶（LonA）是一種在原核生物和真核生物細胞器中保守的ATP依賴性蛋白酶。LonA組裝為同源六聚體，每個單體都包含一個N端結(jié)構(gòu)域、一個中間ATP酶結(jié)構(gòu)域和一個C端蛋白酶結(jié)構(gòu)域。LonA通過降解受損或錯誤折疊的異常蛋白質(zhì)在細胞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，從而防止這些不需要的蛋白質(zhì)種類形成有毒聚集體。LonA還通過降解特定的調(diào)節(jié)蛋白來調(diào)控多種生物過程。

前人的研究揭示了LonA的多種功能和結(jié)構(gòu)特征。具有開放活性位點構(gòu)象的Lon蛋白酶域采用六重對稱結(jié)構(gòu)，而具有非活性蛋白水解位點構(gòu)象的LonA則采用開放螺旋六聚體結(jié)構(gòu)。ADP結(jié)合的LonA六聚體的晶體結(jié)構(gòu)揭示了ADP如何通過誘導(dǎo)形成封閉的降解室來抑制LonA活性。通過假設(shè)來自兩對三個非相鄰單體的無核苷酸和ADP結(jié)合狀態(tài)之間的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，建立了基于ADP結(jié)合結(jié)構(gòu)底物易位模型。然而最近的底物結(jié)合AAA+蛋白的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)不支持上述簡單的一步轉(zhuǎn)換模型，認為其ATP酶結(jié)構(gòu)域圍繞中心定位的底物多肽鏈以螺旋梯狀排列，包括最近人源和鼠疫耶爾森氏菌Lon蛋白酶的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)均支持持續(xù)性旋轉(zhuǎn)機制。但在這些工作中，用于重構(gòu)的細菌Lon是一個Walker-B突變體；而人源Lon的結(jié)構(gòu)則顯示了不同的底物結(jié)合方式和核苷酸結(jié)合狀態(tài)，表明Lon可能存在復(fù)雜的底物轉(zhuǎn)移機制。

10月10日，張凱銘和張崇毅團隊合作在期刊JBC發(fā)表題為“Molecular basis for the ATPase-powered substrate translocation by the Lon AAA+ protease”的文章。張凱銘課題組李珊珊等解析了Meiothermus taiwanensis Lon底物結(jié)合狀態(tài)的3.6-?冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)ATPase結(jié)構(gòu)域的雙孔環(huán)介導(dǎo)底物相互作用，由處于不同ATP結(jié)合和水解狀態(tài)的四個連續(xù)單體以螺旋梯狀排列，揭示了其通過LonA特異性變構(gòu)實現(xiàn)持續(xù)性旋轉(zhuǎn)易位的分子機制。

AAA+蛋白酶與底物結(jié)合的核苷酸結(jié)合狀態(tài)比較

頂部視圖顯示了核苷酸和底物的結(jié)合狀態(tài)。與底物結(jié)合的原體呈不同深淺的綠色。

然而到目前為止，Lon六聚體的現(xiàn)有報道的所有結(jié)構(gòu)中沒有包含N端區(qū)域，Lon如何選擇蛋白質(zhì)靶標作為底物、控制底物進入AAA+結(jié)構(gòu)域、并介導(dǎo)底物去折疊的機制尚不清楚。

10月15日，合作團隊在期刊Sciences Advances繼續(xù)發(fā)表題為“Complete three-dimensional structures of the Lon protease translocating a protein substrate”的延續(xù)性工作。張凱銘課題組李珊珊等利用冷凍電鏡進一步解析了Meiothermus taiwanensis Lon底物結(jié)合狀態(tài)的完整三維結(jié)構(gòu)，分辨率達2.4 ?。這些結(jié)構(gòu)顯示了一個具有張拉整體三角形復(fù)合體的多層結(jié)構(gòu)，獨特地由六個長N端螺旋構(gòu)成。相互鎖定的螺旋三角形組裝在六聚體核心的頂部，以展開一個由六個球狀底物結(jié)合域組成的網(wǎng)。它作為一個多用途平臺，控制底物進入AAA+環(huán)、提供基于標尺的底物選擇機制、并充當滑輪裝置以促進AAA+環(huán)將ATP驅(qū)動的構(gòu)象變化轉(zhuǎn)化為機械力來推動易位底物的展開。該研究成果為理解Lon和其他具有類似活性的AAA+蛋白酶的結(jié)構(gòu)機制提供了一個完整的框架。

全長Lon的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析。a.冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。b.三維原子模型。c,d.二類單體的結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域示意圖。e.作用機制示意圖。

斯坦福大學(xué)Wah Chiu院士為此工作提供了寶貴意見。本研究獲得了Stanford-SLAC電鏡平臺、臺灣中央研究院電鏡平臺和中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)細胞動力學(xué)教育部重點實驗室及冷凍電鏡平臺的大力支持。中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)為第一完成單位，生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部李珊珊副研究員為第一作者，張凱銘、張崇毅研究員為共同通訊作者。

Sciences Advanceslink：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abj7835

JBClink （掃描下方二維碼打開）

（細胞動力學(xué)教育部重點實驗室、合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國家研究中心、中國科大生醫(yī)部、科研部）