人類基因組DNA提取
一、人類基因組DNA提取實驗簡介:
人類基因組DNA提取實驗中所用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞膜,收集細(xì)胞核,添加SDS破壞核膜,使用蛋白酶K將核蛋白降解為小片段,然后從DNA上解離,通過苯酚-氯仿提取去除蛋白質(zhì),然后用無水乙醇,75。用%乙醇洗滌DNA沉淀物,真空干燥,并溶解在TE中以獲得高分子量DNA。
二、人類基因組DNA提取實驗所需試劑:
1.5ml Ep離心管,蛋白酶K溶液,NaAc,1000ul藍(lán)吸頭
三,人類基因組DNA提取實驗步驟:
1.細(xì)胞分裂和RNase /蛋白酶K消化
①將100微升抗凝全血放入1.5ml Ep離心管中,然后加入100微升裂解物和20微升RNaseA /蛋白酶K溶液,來回吸打混合,并在55°C孵育35min將離心管倒置來回幾次直到溶液是水溶性的。
②加入10微升的3M NaAc(pH 4.8),然后加入1250微升的結(jié)合緩沖液,充分搖勻以在12,000 rpm下離心30秒。
2. DNA與吸附柱結(jié)合
用移液管轉(zhuǎn)移上清液,并將其加入離心吸附柱(設(shè)置收集管)中,靜置1min以離心12,000 rpm30秒,然后將廢液丟棄在收集管中。注意:待轉(zhuǎn)移的上清液約為1300微升,而離心吸附柱的容量約為650微升,因此每次需要將650微升的上清液轉(zhuǎn)移至離心吸附柱,進(jìn)行離心處理,將廢液丟棄在收集管中,然后重復(fù)實驗操作步驟3。
3. DNA的純化
①在離心吸附柱(設(shè)置收集管)中加入600微升洗滌緩沖液(洗滌緩沖液),以離心12,000 rpm30秒。
②重復(fù)步驟4一次,以離心12,000 rpm3分鐘以完全除去洗滌緩沖液。
③小心取出離心吸附柱,棄去收集管,將離心吸附柱放入干凈的1.5ml Ep離心管中,向離心吸附柱添加50微升分離緩沖液(洗脫緩沖液)(代替緩沖液,必須添加在離心吸附柱的中央)靜置1min,以離心12,000 rpm30秒。
④取出裝有提取的基因組DNA的Eppendorf離心管。
4. DNA的瓊脂糖凝膠電泳
取8-10微升基因組DNA,加入2微升上樣緩沖液,充分混合,將樣品加入1%瓊脂糖凝膠斑點中,然后進(jìn)行電泳。