20世紀(jì)60年代后期流式細(xì)胞術(shù)開(kāi)始得到廣泛應(yīng)用，通過(guò)流式細(xì)胞儀可以快速的定量分析細(xì)胞群的物理化學(xué)特征，同時(shí)可以根據(jù)這些物理化學(xué)特征對(duì)銑刀進(jìn)行精確分選。今天就來(lái)簡(jiǎn)單的介紹一下流式細(xì)胞術(shù)。

流式細(xì)胞儀

首先我們簡(jiǎn)單的了解一下流式細(xì)胞儀，市面上的流式細(xì)胞儀型號(hào)有許多種，但其基本結(jié)構(gòu)都是相同的，分析性流式細(xì)胞儀幾乎都是由液流系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、檢測(cè)分析系統(tǒng)組成。

1.液流系統(tǒng)?

2.光路系統(tǒng)光路系統(tǒng)始于激光器，其分類(lèi)方法繁多，最常見(jiàn)的分類(lèi)方法是根據(jù)其發(fā)射的激光的波長(zhǎng)來(lái)分，常見(jiàn)的有藍(lán)激光器488nm、紅激光器635nm和紫激光器405nm，不同的激光器發(fā)出的激光照射到細(xì)胞后產(chǎn)生的光信號(hào)會(huì)經(jīng)過(guò)不同的光路系統(tǒng)被不同的通道接收。流式細(xì)胞儀采集的光信號(hào)包括散射光信號(hào)和熒光信號(hào)，散射光信號(hào)也就是我們常說(shuō)的FSC（前向散射光，反應(yīng)細(xì)胞的大小）、SSC（側(cè)向散射光，反應(yīng)細(xì)胞的復(fù)雜程度）；熒光信號(hào)是細(xì)胞上結(jié)合有熒光素，被激光激發(fā)以后，會(huì)發(fā)射熒光信號(hào)。

3.檢測(cè)分析系統(tǒng)檢測(cè)分析系統(tǒng)就是以通道為單位將細(xì)胞的各個(gè)通道的光信號(hào)匯總分析，最后得出樣品群體中細(xì)胞的物理化學(xué)特征。其中通道（光電倍增管）有2個(gè)作用：①將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娮有盘?hào)；②放大電子信號(hào)?？梢苑譃樯⑸涔馔ǖ溃‵SC通道、SSC通道）和熒光通道，一個(gè)激光器下可以有多個(gè)熒光通道，一個(gè)通道對(duì)應(yīng)多個(gè)熒光染料。

樣品細(xì)胞檢測(cè)流程

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的對(duì)象一般是呈獨(dú)立狀態(tài)的懸浮于液體中的細(xì)胞，如果要檢測(cè)組織中的細(xì)胞，則必須先將組織制備成單細(xì)胞懸液，而后方可進(jìn)行檢測(cè)。

制備基本流程如下：

1.細(xì)胞的培養(yǎng)、制備將一定數(shù)量的單個(gè)細(xì)胞收集于1.5mL的EP管中，2400rpm、4℃離心4min，棄上清；加入1xPBS清洗，同等條件進(jìn)行離心，棄上清。

2.封閉用來(lái)標(biāo)記樣品細(xì)胞的熒光素偶聯(lián)抗體多為單克隆抗體，少數(shù)也可能是多克隆抗體，但其基本結(jié)構(gòu)都是由兩部分組成：包含有特異性結(jié)合抗原位點(diǎn)的Fab段、相對(duì)保守的Fc段?？贵w的特異性表現(xiàn)在Fab段，標(biāo)記時(shí)利用Fab段的抗原結(jié)合位點(diǎn)與細(xì)胞上抗原分子進(jìn)行特異性結(jié)合，從而進(jìn)行標(biāo)記并且相對(duì)量化的展示了細(xì)胞表達(dá)該抗原分子的情況。
3.熒光素偶聯(lián)抗體標(biāo)記以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC為例，一般染色體系推薦100μl，CD3、CD4表達(dá)量相對(duì)較高，1μl足夠了，假如有9個(gè)樣本，分別取10μlCD3-APC-cy7、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中，混勻后，分別取100μl加到9個(gè)樣品孔中，混勻，室溫、避光染色20min。時(shí)間到后加1ml FACS buffer洗去未結(jié)合的抗體，2400rpm、4°C離心4min，棄上清，加200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重懸沉淀，并盡快上機(jī)分析。

4.光電倍增管電壓的設(shè)定上機(jī)分析時(shí)，在確認(rèn)機(jī)器沒(méi)有問(wèn)題后，需調(diào)節(jié)每個(gè)通道的光電倍增管的電壓，從而區(qū)分細(xì)胞群，利用FSC和SSC，通過(guò)調(diào)節(jié)FSC和SSC的電壓，區(qū)分淋巴細(xì)胞亞群，使樣品細(xì)胞或者目標(biāo)細(xì)胞位于流式圖的中央或者靠近中央的位置。FSC和SSC的電壓確定之后還需調(diào)節(jié)APC-cy7、FITC的電壓，使陽(yáng)性細(xì)胞群和陰性細(xì)胞群盡可能的分離。
5.設(shè)置對(duì)照，補(bǔ)償調(diào)節(jié)流式實(shí)驗(yàn)中對(duì)照設(shè)置很重要，常見(jiàn)的有陰性對(duì)照、FMO對(duì)照、補(bǔ)償單陽(yáng)管對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1.?因?qū)嶒?yàn)需保證待檢測(cè)樣品細(xì)胞為單細(xì)胞懸液，因此在細(xì)胞培養(yǎng)、制備階段，貼壁細(xì)胞需用先用胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，而后再后收集待測(cè)樣品細(xì)胞；胸腺、脾臟和淋巴結(jié)等外周免疫器官，主要由免疫細(xì)胞組成，只需直接將臟器經(jīng)鋼網(wǎng)研磨即可制成單細(xì)胞懸液；實(shí)體臟器肺臟、肝臟和腫瘤組織內(nèi)含有較多的結(jié)締組織，而實(shí)體臟器細(xì)胞之間一般結(jié)合緊密，所以直接簡(jiǎn)單的將臟器進(jìn)行研磨是無(wú)法得到理想的單細(xì)胞懸液的，因此，研磨前需將臟器剪碎后加入IV型膠原酶和DNA核酸內(nèi)切酶消化，而后再將消化后的組織用研磨棒直接研磨，從而得到理想的單細(xì)胞懸液（實(shí)體臟器研磨后的單細(xì)胞懸液以實(shí)體細(xì)胞為主，如果研究目標(biāo)不是實(shí)體細(xì)胞，而是臟器內(nèi)浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞，可以用Percoll密度梯度離心法富集免疫細(xì)胞）。而后對(duì)收集到的理想的單細(xì)胞懸液進(jìn)行離心、洗滌、封閉、標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體后，即可進(jìn)行流式分析。

2.?調(diào)節(jié)電壓時(shí)，如果檢測(cè)的目標(biāo)細(xì)胞體積較小，可以適當(dāng)提高電壓值，使目標(biāo)細(xì)胞與細(xì)胞碎片在流式圖中能夠完全分離；如果檢測(cè)的目標(biāo)細(xì)胞體積較大，可以適當(dāng)降低電壓值，使所有的目標(biāo)細(xì)胞群完整顯示于流式圖中，防止細(xì)胞群接近于流式圖的邊界而變形扭曲或者完全處于邊界外。

3.?關(guān)于樣本的封閉，并不是標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體之前必須封閉樣品，一般樣品細(xì)胞與流式抗體的種屬來(lái)源是不同的，如標(biāo)記人的細(xì)胞的熒光素偶聯(lián)抗體一般來(lái)源于小鼠，人細(xì)胞的FcR也不一定能夠與小鼠來(lái)源的熒光素偶聯(lián)抗體的Fc段結(jié)合，但是，也有可能因?yàn)榉N屬關(guān)系較近，或者在一定環(huán)境條件下這種不同種屬間的Fc段和FcR也能結(jié)合，實(shí)驗(yàn)者很難判斷實(shí)驗(yàn)過(guò)程中這種結(jié)合是否會(huì)發(fā)生，但是在標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體前封閉樣品卻可以保證這種非特異性結(jié)合一定不會(huì)發(fā)生。所以，當(dāng)條件允許時(shí)，實(shí)驗(yàn)者最好選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行封閉處理。

作者：海星生物

公眾號(hào)：Cas9X細(xì)胞基因敲除

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