寫在前面

? ? 怎么說呢，這個系列就是把自己的homework拿出來曬一曬，也就是圖一樂丟人現(xiàn)眼一下，因為本人能力和知識范圍有限，難免會有錯誤，請諒解一下，也就是僅供參考。引文都有標(biāo)注，如果有侵權(quán)的可以聯(lián)系我。歡迎各位大佬多交流，提問題、指錯誤。要是能關(guān)注一波那就更好了?

淺談熒光素酶的相關(guān)研究

熒光素酶（luciferase）是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的總稱，生物發(fā)光（Bioluminescence）是自然界廣泛存在的，由生物產(chǎn)生的一種發(fā)光現(xiàn)象。能夠產(chǎn)生生物熒光的生物種類繁多，包括發(fā)光細(xì)菌、發(fā)光螢火蟲、發(fā)光魚、發(fā)光海星、發(fā)光甲蟲等其中細(xì)菌熒光素酶（Bacterial?Luciferase，BL）和對螢火蟲熒光素酶（Firefly?Luciferase，F(xiàn)L）的研究是最多最廣泛的.目前熒光素酶基因在基因工程方面已成為廣泛使用的報告基因，由于熒光素酶檢測簡便、靈敏、快速，且大多數(shù)生物無內(nèi)源熒光，利用熒光素酶基因作為報告基因幾乎無背景干擾，同時熒光素酶在發(fā)光免疫分析及環(huán)境監(jiān)測、微生物檢測等方面的應(yīng)用正愈來愈受到關(guān)注。[1-2]

1 熒光素酶研究的發(fā)展歷程

早在1885年Dubois提出生物發(fā)光是由“熒光素酶”與“熒光素”的化學(xué)反應(yīng)引起的發(fā)光現(xiàn)象。1954年，Meclroy等對從哈氏弧菌中提取并純化出細(xì)菌熒光素酶。1967年，F(xiàn)riedland等對從費氏弧菌中提取出的熒光素酶的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)原理進行了分析。1956年，GreenA等提取出螢火蟲熒光素酶。在1970年，Denburg等第一次測定了螢火蟲熒光素酶的結(jié)構(gòu)。1985年，Dewet J.R.等首次克隆了P.Pyralis的熒光素酶基因，并在大腸桿菌中表達，從中獲得了具有活性的熒光素酶。1986年他們又測定了熒光素酶基因的cDNA序列，1986年，Marlene等第一個成功地獲得表達螢火蟲熒光素酶基因（luc基因）的轉(zhuǎn)基因煙草，熒光素酶的應(yīng)用和發(fā)展進入了一個嶄新的時代。[1][3]

2熒光素酶的發(fā)光機制

2.1 細(xì)菌熒光素酶

不同種類的發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光機制是相同的，是由特異性的熒光素酶催化，還原性的黃素（FMNH2）、八碳以上長鏈脂肪醛（RCHO）、氧分子（O2）所參與的復(fù)雜的氧化反應(yīng)，在450～490nm時發(fā)射藍綠光。

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與其他酶相同，BL的活性也會受到多方面因素的影響，例如反應(yīng)中的FMN、RCHO、O2、BL、pH和溫度都會影響B(tài)L的酶活。還有研究指出，在RCHO缺乏的情況下，熒光素酶也可以催化FMNH2和O2反應(yīng)，生成FMN和H2O2，但只能發(fā)出極其微弱的光。而在RCHO存在的條件下則可以發(fā)出持續(xù)的、穩(wěn)定的熒光。[1-2]

2.2 螢火蟲熒光素酶

螢火蟲熒光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)必須要ATP和蟲熒光素（Firefly?luciferin）的參與。蟲熒光素是一種可以被氧化的底物，在ATP，Mg2＋，O2存在的條件下，它在蟲熒光素酶的催化下氧化發(fā)光，由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)同時產(chǎn)生綠光。

影響蟲熒光素酶發(fā)光強度的因素很多：包括ATP、熒光素、O2、Mg2＋的濃度，pH及反應(yīng)溫度等。[1-2]

3 熒光素酶的應(yīng)用

3.1 作為報告基因檢測系統(tǒng)

?熒光素酶基因（lux）表達的直接結(jié)果是產(chǎn)生生物熒光，而且反應(yīng)非常迅速且易于檢測，因而被廣泛用于基因操作中，作為標(biāo)記基因和報告基因來研究基因的轉(zhuǎn)錄、表達和調(diào)控。熒光素酶報告基因具有檢測快、靈敏度高、穩(wěn)定性好、線形范圍廣、不損害檢測對象、干擾少等優(yōu)點．

此外蟲熒光素酶－海星熒光素酶的雙熒光素酶報告系統(tǒng)也為研究RNAi、miRNA、siRNA等提供了工具。[1-3]

3.2 ATP含量檢測

ATP既是FL催化發(fā)光的必需底物，又是所有生物生命活動的能量來源。傳統(tǒng)ATP測定方法操作復(fù)雜，靈敏度低，缺乏足夠的專一性。而在FL催化的發(fā)光反應(yīng)中，當(dāng)ATP在一定的濃度范圍內(nèi)時，其濃度與發(fā)光強度呈線性關(guān)系，因此，利用熒光素酶測定ATP具有快速靈敏的特點。[2]

3.3 研究蛋白質(zhì)的相互作用

2002年，R．Paul?murugan應(yīng)用蟲熒光素酶對成肌調(diào)節(jié)因子（MyoD）和細(xì)胞分化抑制因子（Id）之間的強相互作用進行了研究．2004年，Sung等也利用這種原理把海星熒光素酶進行了剪切與重聚，研究了雄激素受體在小鼠中的易位作用。熒光素酶為研究哺乳動物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的磷酸化和蛋白之間的相互作用提供了一個新的、可靠的、快速的方法．同樣也可以用于研究細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，優(yōu)化用于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)之間相互作用的藥物．[1]

3.4 環(huán)境質(zhì)量檢測

用基因工程改造發(fā)光細(xì)菌可以進行微生物在水、土壤、空氣中分布的研究，還可以用于測定一些化學(xué)物質(zhì)及污染物的毒性、監(jiān)測河流水質(zhì)、進行空氣質(zhì)量評價等。

在正常條件下，發(fā)光細(xì)菌在450～490nm時發(fā)出藍綠色可見光．與被檢物（如污水等）接觸后，當(dāng)被檢物中具有抑制發(fā)光細(xì)菌的物質(zhì)達到一定濃度時，則發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強度將發(fā)生改變，其變化的程度與抑制物的毒性大小有關(guān)，并與抑制物質(zhì)的濃度在一定范圍內(nèi)相關(guān)在正常條件下，

1994年，Zomer等應(yīng)用熒光素酶催化的生物發(fā)光現(xiàn)象進行水、土壤、食品等樣品中有機磷和氨基甲酸酯等殺蟲劑的靈敏檢測。其原理是昆蟲腦提取物中有殺蟲劑攻擊的受體或酶結(jié)合位點，將生物發(fā)光的底物——D-Luciferin衍生物滲透至昆蟲腦提取物中，昆蟲腦提取物能將D-Luciferin衍生物水解為D-Luciferin，添加ATP和FL，即可發(fā)生生物發(fā)光，而殺蟲劑能抑制這種水解活性，通過檢測發(fā)光強度，即可計算殺蟲劑的濃度。[1-2]

4 展望與思考

從19世紀(jì)開始到今天，對熒光素酶和熒光素酶基因的研究得越來越深入，其以高特異性、反應(yīng)速度快、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點在生物學(xué)各個領(lǐng)域都有較大的應(yīng)用。

但由于熒光素酶在溶液中的不穩(wěn)定性及其來源的局限，熒光素酶的應(yīng)用的價格比較昂貴，若重頭設(shè)計熒光素酶，將其合成途徑及性質(zhì)改造得更便于人類利用，在保證現(xiàn)有優(yōu)勢的情況下，變得更加穩(wěn)定，合成途徑更加簡便可控，使得熒光素酶的應(yīng)用范圍進一步拓寬。

此外，是否可以利用多種不同的熒光素酶或者設(shè)計不同熒光素酶的底物，將其發(fā)射波長相錯開，在原有的雙熒光素酶報告系統(tǒng)上進行改造，實現(xiàn)多角度實時監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)或動物體內(nèi)的基因多維變化或者基遺傳信息傳遞的動態(tài)過程，以此來發(fā)現(xiàn)或驗證基因的各種協(xié)同功能，例如監(jiān)測不同增強子對同一對基因的相互作用與時空特性。

最后，若將熒光素酶改造并應(yīng)用于生物傳感器或環(huán)境監(jiān)控器，是否可以獲得極其靈敏的環(huán)境檢測器，來測定特定的環(huán)境中的污染濃度或者應(yīng)用于特點疾病的實時監(jiān)控、特定藥物濃度的動態(tài)變化等等。

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參考文獻：

[1]?楊穎，張逢春.熒光素酶的分類、結(jié)構(gòu)與應(yīng)用[J].北華大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版),2006(05):411-415.

[2]?張菊梅，吳清平，周小燕，郭偉鵬，吳慧清，王元平.熒光素酶研究進展[J].微生物學(xué)通報，2001(05):98-101.DOI:10.13344/j.microbiol.china.2001.05.025.

[3]?胡敬志. 螢火蟲熒光素酶的性質(zhì)和應(yīng)用的研究[D].華東師范大學(xué)，2007.

[4]?劉建武，孫成華，劉寧.熒光素酶及其應(yīng)用[J].生物學(xué)通報，2004(02):15-17.

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