NK-92 (人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細(xì)胞) 是從外周血單核細(xì)胞衍生來的、IL-2依賴型NK細(xì)胞株。

下面將為同學(xué)們?cè)敿?xì)闡釋NK-92細(xì)胞特性及培養(yǎng)注意事項(xiàng)。

1.NK-92細(xì)胞特性

NK-92細(xì)胞生長(zhǎng)特性為懸浮生長(zhǎng)，收到細(xì)胞后先觀察瓶身是否完整，無漏液現(xiàn)象，培養(yǎng)基是否澄清透亮，在顯微鏡下觀察細(xì)胞；

用75%的酒精擦拭瓶身后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶先豎立靜置2~4個(gè)小時(shí)，讓細(xì)胞沉降到底部；細(xì)胞靜置完后，將瓶中上面部分培養(yǎng)基小心吸出，留底部細(xì)胞和3ml左右培養(yǎng)基在原瓶；

吸出的細(xì)胞培養(yǎng)基離心收集細(xì)胞沉淀，離心轉(zhuǎn)速1000轉(zhuǎn)3分鐘，或根據(jù)您的離心機(jī)實(shí)際情況而定，NK-92細(xì)胞對(duì)離心敏感，轉(zhuǎn)速不宜過高；用2~3mlNK-92完培將得到的細(xì)胞沉淀重懸后，放回原瓶繼續(xù)培養(yǎng)過夜，一個(gè)T25培養(yǎng)體積是5~6毫升；

NK-92細(xì)胞可按照200U/ml的濃度補(bǔ)加IL-2。

培養(yǎng)瓶為不透氣瓶蓋，一定要擰松到不掉的程度，使細(xì)胞充分透氣；培養(yǎng)瓶橫放，瓶口擰松透氣，培養(yǎng)過夜；

顯微鏡下觀察細(xì)胞，視細(xì)胞密度和培養(yǎng)基消耗情況，進(jìn)行傳代。不建議直接進(jìn)行離心操作，因?yàn)榻?jīng)過運(yùn)輸顛簸和各種處理，細(xì)胞很可能達(dá)不到最佳狀態(tài)。盡量不要吹散細(xì)胞團(tuán)，加完液輕晃培養(yǎng)瓶即可。

2.細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

NK-92細(xì)胞為懸浮生長(zhǎng)，大部分細(xì)胞聚集成團(tuán)，少數(shù)細(xì)胞分散，并且細(xì)胞間隙會(huì)有較多的死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，且培養(yǎng)過程中經(jīng)常能觀察黑色的顆粒和小黑點(diǎn)，這些黑點(diǎn)大概是細(xì)胞帶的，一般少量黑點(diǎn)不增殖不會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，若黑點(diǎn)繁殖生長(zhǎng)則懷疑細(xì)胞污染，會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至使細(xì)胞死亡。

NK-92細(xì)胞對(duì)IL-2敏感。培養(yǎng)基中IL-2降解，將導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差。IL-2長(zhǎng)期保存溫度為-20℃，解凍后置于4℃冰箱保存，4℃保存不應(yīng)超過兩周。配制好的新鮮培養(yǎng)基要盡快用完，使用前預(yù)熱，使用完畢后放回4℃冰箱保存；

NK-92細(xì)胞對(duì)離心敏感。正常培養(yǎng)時(shí)，換液周期為2~3天，建議交替使用半量換液和離心換液法，即半量換液2~3次后，離心全量換液一次。盡量減少離心次數(shù)，細(xì)胞狀態(tài)不佳或細(xì)胞量少的時(shí)候，一般不建議離心。

細(xì)胞團(tuán)塊是否需要吹散？團(tuán)塊需要吹散，但不用刻意吹散成單顆；正常傳代或者離心換液后吹打，控制吹打次數(shù)以及力度，即使細(xì)胞都分散成單個(gè)，也會(huì)在1~2天內(nèi)聚集起來；細(xì)胞團(tuán)太大時(shí)，需要分散；細(xì)胞凍存的時(shí)候，細(xì)胞需要盡量分散，否則影響凍存效果。

3.換液方法

(1) 補(bǔ)液法：每2~3天補(bǔ)加適量（根據(jù)培養(yǎng)容器和原來細(xì)胞懸液體積來定，T25瓶一次補(bǔ)液1~2毫升即可）新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)補(bǔ)加200U/mlIL-2，補(bǔ)加2-3次之后，離心全部換液。

(2) 半換液法：以T25瓶子（瓶中裝有5ml培養(yǎng)基）為例，豎起瓶子靜置一段時(shí)間（豎瓶前輕拍培瓶，讓輕貼底部的細(xì)胞團(tuán)浮起來），待細(xì)胞沉底（肉眼觀察細(xì)胞沉底情況），小心吸出2.5ml上清轉(zhuǎn)移到離心管，1000rpm 3~5min離心，離心后的細(xì)沉淀用2.5ml新鮮培養(yǎng)重懸后放回原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，聚集的細(xì)胞團(tuán)會(huì)逐漸增大，正常的細(xì)胞團(tuán)在顯微鏡下呈現(xiàn)白色透亮狀。若細(xì)胞聚集太多，出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)中部發(fā)暗時(shí)，可進(jìn)行傳代。

4.傳代方法

將細(xì)胞團(tuán)用移液器輕輕吹散（一般吹2-3次即可，吹打力度不可過大，否則會(huì)出現(xiàn)大量死細(xì)胞和細(xì)胞碎片），均分到兩個(gè)瓶子里，每瓶再補(bǔ)充等量完全培養(yǎng)基。

細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)要求很高，細(xì)胞量過多時(shí)會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)；細(xì)胞團(tuán)塊過大時(shí)，需要稍微吹散，注意控制吹打次數(shù)，不需要全部吹散。

5.細(xì)胞凍存

推薦使用90%FBS+10%DMSO的凍存液配比，NK-92細(xì)胞可適量補(bǔ)加IL-2；盡量吹散細(xì)胞，注意控制吹打力度。

6.細(xì)胞復(fù)蘇

細(xì)胞復(fù)蘇操作步驟如下：復(fù)蘇后，用6ml新鮮完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞；離心后去除上清用1^2mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，注意要少次輕柔吹打。瓶子豎著放進(jìn)培養(yǎng)箱，以增加細(xì)胞局部密度，瓶蓋保持透氣；細(xì)胞生長(zhǎng)需要穩(wěn)定的環(huán)境，可每天觀察1次，不要頻繁拿出培養(yǎng)箱觀察。

作者：海星生物

公眾號(hào)：Cas9X細(xì)胞基因敲除

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