衰老被認為是“與時間有關(guān)的生存和生育所必需生理功能的惡化”。因此，科學(xué)家們必須找到有效的方法來研究驅(qū)使機體衰老的原因。生理衰老的分子本質(zhì)依舊是十分復(fù)雜，目前研究人員無法完全解開其中涉及的過程和基因，也就是說，到目前為止，分子水平的衰老過程還沒有得到充分的探索。但是，有九個特征被發(fā)現(xiàn)并被稱為衰老的潛在標志：1）基因組不穩(wěn)定，導(dǎo)致遺傳損傷的內(nèi)部和外部因素均可加速衰老；2）端粒磨損，端粒的保護性“帽”在每次細胞分裂時變短，并且隨著時間的流逝，細胞失去其分裂能力，從而有引起疾病的可能；3）表觀遺傳的改變，通過個體的生活經(jīng)歷或影響衰老的環(huán)境因素改變基因表達（但不是DNA本身的變化）；4）蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的喪失，隨著年齡的增長，細胞蛋白質(zhì)發(fā)生了錯誤的折疊，因此失去其穩(wěn)態(tài)功能（通過衰老或與年齡有關(guān)的疾病觀察受損的蛋白質(zhì)）；5）失調(diào)的營養(yǎng)素感應(yīng)，特別是代謝調(diào)節(jié)途徑的蛋白質(zhì)（例如mTOR，sirtuins）會受營養(yǎng)水平和促進衰老的影響；6）線粒體功能障礙促使衰老；7）改變后的細胞間通訊功能障礙導(dǎo)致炎癥和組織損傷；8）細胞衰老破壞細胞的清潔過程，“舊”細胞的沉積可能引起不利于健康的影響；最后，9）干細胞衰竭，減少組織細胞的再生，促成衰老。

衰老是身體衰弱的主要誘因，舉幾個例子，如心臟病，癌癥和阿爾茨海默病。盡管仍有許多東西有待發(fā)現(xiàn)，但與衰老有關(guān)的模式和其聯(lián)系已被逐漸挖掘出來，這使得針對與年齡相關(guān)的疾病的有效干預(yù)的抗衰老療法的需求出現(xiàn)了。現(xiàn)如今，研究人員已經(jīng)在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了幾種能延長壽命的基因，將遺傳學(xué)與衰老相關(guān)的損傷聯(lián)系了起來。如果是涉及到了基因，那么我們就可以利用CRISPR技術(shù)進行基因編輯。然而，即使在體內(nèi)每種細胞類型中編輯單個基因的可能性是存在的，在成人中也很難做到。因此，我們需要確定哪些細胞可以編輯，應(yīng)該靶向哪些氧化損傷基因。同樣，線粒體DNA和基因組DNA的不穩(wěn)定性也是造成年齡相關(guān)損傷的主要原因。這表現(xiàn)為DNA中的小突變，而這些小突變會隨著細胞類型的補充和更新，發(fā)生并在整個身體中積累。2019年，“自然醫(yī)學(xué)雜志”重點介紹了一種新型CRISPR/Cas9基因組編輯療法，該療法可以抑制有Hutchinson-Gilford早衰綜合征的小鼠衰老。Hutchinson-Gilford早衰綜合征是一種罕見的遺傳性疾病，同樣也會發(fā)生在人類身上。這種治療方法為衰老所涉及的分子途徑以及如何通過基因治療減少有毒蛋白質(zhì)提供了重要見解。最近的研究表明，細胞衰老也是衰老和年齡相關(guān)病理的驅(qū)動因素。衰老細胞的特征不僅在于細胞周期停滯，還在于強效促炎表型，這被認為是驅(qū)動衰老和與年齡相關(guān)的疾病。消除小鼠中的衰老細胞的結(jié)果已經(jīng)表明可以逆轉(zhuǎn)與年齡相關(guān)的病理，表明靶向衰老細胞可以是促進健康衰老的有力策略。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以顯著改善人類的生理健康和壽命。基因組編輯可以為科學(xué)家對如何去針對人類衰老的分子驅(qū)動因素提供重要的新理解。我們用這種技術(shù)能達到效果始終是有限的，因為我們不能重新編輯整個身體，也不能讓人們永遠地活著。但是，如果我們能夠修復(fù)身體的一些損耗的部位，這將使我們能夠隨著年齡的增長享受更優(yōu)質(zhì)的生活質(zhì)量。新開發(fā)的CRISPR-Cas9技術(shù)不僅可以支持衰老和衰老相關(guān)疾病的遺傳模型的發(fā)展，而且可以加強我們對癌癥、帕金森病、亨廷頓舞蹈病等相關(guān)疾病發(fā)病機制的認識，這些疾病隨著人類預(yù)期壽命的延長而變得越來越普遍地出現(xiàn)。基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的新型基因組編輯技術(shù)以及強大的數(shù)據(jù)輸出可以有助于我們更好地理解衰老的邏輯，并在不久的將來揭開一些衰老的奧秘。

應(yīng)用：

1. 遺傳學(xué)和功能基因組學(xué)：影響壽命的突變；基因同源性；器官和細胞衰老；基因操作。

2. 信號傳導(dǎo)和基因表達：將年齡相關(guān)變化與表型和生理學(xué)聯(lián)系起來的機制；細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)；細胞和組織之間的相互作用；激素，免疫和炎癥系統(tǒng)。

3. 細胞增殖，衰老和死亡：復(fù)制衰老；細胞凋亡；端粒生物學(xué)和其他內(nèi)在和外在影響；按時間順序的細胞衰老；衰老細胞的表型。

4. 細胞應(yīng)激和損傷：自由基對細胞和組織的外在和內(nèi)在影響；自由基防御和損傷；自由基作為信號分子；壓力和衰老。

5. 干細胞和衰老：年齡對干細胞生成的影響；細胞遷移和體內(nèi)平衡；干細胞-生態(tài)位相互作用；調(diào)節(jié)機制。

6. 綜合生理學(xué)：細胞，分子和生物水平老化過程的結(jié)果。

7. 潛在的臨床應(yīng)用：改善預(yù)防，治療疾病，更好地了解衰老的病理過程。

8. 藥物與衰老：藥物發(fā)現(xiàn)，篩選，最佳藥物治療。

研究衰老相關(guān)的CRISPR-U?基因組編輯

據(jù)世界衛(wèi)生組織稱，在生物水平上，衰老是由于隨著時間的推移各種分子和細胞損傷積累下來所造成的影響。其中有9個特征被稱為衰老的潛在標志，如基因組不穩(wěn)定，端粒磨損，表觀遺傳改變和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)喪失等。迄今為止，專門研究衰老的研究人員在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了幾種延長壽命并將遺傳學(xué)與衰老相關(guān)損傷聯(lián)系起來的基因。CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種革命性的基因組編輯工具，可用于精確的基因組編輯，并可通過用所需donor序列替換掉靶基因序列來進行基因敲除或敲入的基因組編輯操作。基因編輯工具能夠糾正由基因介導(dǎo)的年齡相關(guān)病理，從而改善或消除疾病癥狀。使用CRISPR系統(tǒng)刪除靶基因或校正基因突變可以改善在老齡化群體中檢測到的許多不同的疾病。CRISPR系統(tǒng)靶向的癌細胞可促進癌細胞對化學(xué)治療劑的敏感性增加，增殖降低和癌細胞死亡增加。源井生物開發(fā)的CRISPR-U?用于真核細胞系的基因編輯操作。因此，可以利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在許多真核細胞中實現(xiàn)基因組編輯。

案例分析：

通過CRISPR/Cas9研究影響端粒代謝的突變

人CTC1基因的錯義突變會導(dǎo)致Coats plus（CP），一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，其特征是視網(wǎng)膜毛細血管擴張，顱內(nèi)鈣化，骨質(zhì)減少和胃腸道出血。人類疾病突變的表征通常會為基本生物學(xué)功能提供寶貴的見解。在這項研究中，研究人員調(diào)查了CTC1L1142H對端粒代謝的影響，并比較了這種CTC1突變在兩種不同細胞類型中的作用，這兩種細胞分別是HCT116結(jié)腸癌細胞系和端粒酶永生化的視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細胞。他們發(fā)現(xiàn)突變體CTC1L1142H與STN1的相互作用較弱，并且CTC1:STN1亞復(fù)合物足以抑制端粒酶介導(dǎo)的端粒延長。不能與DNA Pol-α相互作用的CP突變的表達表明，DNA Pol-α介導(dǎo)的C鏈維持還需要CTC1:STN1來促進這種維持。因此，CST復(fù)合物需要協(xié)調(diào)端粒酶介導(dǎo)的G鏈延伸和DNA Polα介導(dǎo)的C鏈合成以維持端粒長度穩(wěn)態(tài)。

為了從作用機制上理解CTC1 L1142H突變?nèi)绾斡绊慍P患者的端粒代謝，研究人員利用CRISPR/Cas9分別在HCT116細胞系和端粒酶永生化的RPE細胞中，將兩個等位基因上的CTC1 Leu 1142突變?yōu)镠is 1142 。突變細胞系用于測量野生型或L1142H突變型HCT116或RPE細胞系中的增殖能力，內(nèi)源性DNA Pol-a和STN1的表達模式，內(nèi)源性STN1（綠色）和端粒（紅色）的免疫FISH分析。他們發(fā)現(xiàn)CTC1與STN1復(fù)合，負調(diào)節(jié)端粒長度。盡管CTC1 L1142H突變導(dǎo)致RPE細胞中端粒長度在初期有所增加，但這種增長無法穩(wěn)定地維持。

CTC1 L1142H突變體與STN1和DNA Pol-a的相互作用較弱，并且無法結(jié)合ss端粒DNA，這表明CTC1，STN1和DNA Pol-a之間的物理相互作用都需要與ss端粒DNA結(jié)合。為了驗證這一假設(shè)，研究人員通過靈活的10個氨基酸的接頭將突變體Flag-CTC1 L1142H人工接駁到STN1上以試驗是否可以挽救CTC1 L1142H與DNA Pol-a和s s端粒DNA的相互作用。Flag-CTC1 WT-linker-STN1蛋白與DNA Pol-a和ss端粒DNA（圖2a）相互作用都很強烈，完全定位在細胞核中（圖2b），并在野生型和CTC1 L1142H HCT116和RPE細胞（圖2c）中功能性地減少端粒長度。此外，如端粒酶FISH分析所示，F(xiàn)lag-CTC1 WT-liner-STN1構(gòu)建體的表達減少了端粒酶在端粒上的積累（圖2d和e）。他們發(fā)現(xiàn)CTC1需要直接與STN1相互作用才能形成CTC1:STN1（C:S）復(fù)合體。然后，C:S復(fù)合體與DNA Pol-a相互作用，使其能夠與ss端粒DNA穩(wěn)定結(jié)合，并且該C:S:DNA Pol-a復(fù)合物可抑制端粒酶介導(dǎo)的G鏈延伸。

為了檢查TEN1對DNA Pol-a和ss端粒DNA合成的CST復(fù)合物的貢獻，他們首先在HEK293T細胞中表達Flag-CTC1，HA-STN1和Myc-TEN1，并通過Co-IP檢查它們的相互作用。HA-STN1本身與內(nèi)源性DNA Pol-a相互作用較弱，但不包括與Flag-CTC1或Myc-TEN1（圖3a）。盡管C:S和S:T與DNA Pol-a有著良好的相互作用，但三種C:S:T組分的共表達導(dǎo)致與DNA Pol-a更加強烈的結(jié)合。Myc-TEN1的存在增強了Flag-CTC1 L1142H和HA-STN1之間的相互作用，以及Flag-CTC1 L1142H，HA-STN1和DNA Pol-a之間的復(fù)合物形成（圖3b）。因此，這些功能方面上的證據(jù)表明CTC1:STN1是體內(nèi)抑制端粒酶活性必需的因素。CTC1 L1142H蛋白與STN1的相互作用較弱，部分定位于細胞質(zhì)，導(dǎo)致了端粒酶介導(dǎo)的端粒延長（圖2c）。

總而言之，CTC1 L1142H:STN1:TEN1復(fù)合物無法與端粒酶競爭進入3個主要的富含G的突出端。CTC1 L1142H:STN1和DNA Pol-a之間的相互作用減弱導(dǎo)致端粒酶聚集到端粒以及端粒延長，這些發(fā)現(xiàn)進一步表明C:S需要與DNA Pol-a結(jié)合才能完全抑制端粒酶活性。此外，C:S通過DNA Pol-a調(diào)節(jié)C鏈填充。這些發(fā)現(xiàn)證實了CST復(fù)合物是G鏈延伸和C鏈填充反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)劑。

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