在哺乳動(dòng)物中，造血干細(xì)胞和多能祖細(xì)胞(HSCs/MPPs)占據(jù)造血系統(tǒng)的頂端[1]，表現(xiàn)出多向分化和自我更新的能力。然而在目前的HSC/MPP體外擴(kuò)增培養(yǎng)中，如何維持HSC/MPP的體外擴(kuò)增依然存在挑戰(zhàn)。高度血管化的胎肝(FL)是各種來(lái)源造血細(xì)胞(HCS)的短暫發(fā)育場(chǎng)所。FL結(jié)構(gòu)的生態(tài)位細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)、基質(zhì)細(xì)胞和肝母細(xì)胞。然而，HSC/MPP和不同的niche cells之間復(fù)雜相互作用的機(jī)制，以及HSC/MPP擴(kuò)增的系統(tǒng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍然不清楚。為了研究HSC/MPP擴(kuò)增的調(diào)控機(jī)制，文章結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(scRNA-seq)、空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(ST)構(gòu)建了小鼠FL的時(shí)空轉(zhuǎn)錄組圖譜，揭示了HSCs/MPPs的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，解碼了HSC/MPP擴(kuò)增的結(jié)構(gòu)和分子基礎(chǔ)。此外，跨物種比較分析確定了小鼠和人類(lèi)FL血細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)程中保守的和特異性的細(xì)胞和分子事件。

?基本信息?

標(biāo)題：Identification of HSC/MPP expansion units in fetal liver by single-cell spatiotemporal transcriptomics

材料：小鼠胎肝（FL）在E11.5到E14.5之間隔天取樣

期刊：Cell Research

發(fā)表時(shí)間：2021年8月

方法：10× Genomics scRNA-seq，10× Visium?, Stereo-Seq

?內(nèi)容概述?

現(xiàn)有研究對(duì)造血干細(xì)胞和多能祖細(xì)胞(HSC/MPP)在其天然生態(tài)位內(nèi)擴(kuò)增的細(xì)胞和分子機(jī)制了解有限，因此，文章構(gòu)建了小鼠胎肝(FL)的時(shí)空轉(zhuǎn)錄組圖譜。作者使用小鼠胎肝單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)揭示了三個(gè)轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性的HSC/MPP亞群，其中一個(gè)CD93富集的亞群表現(xiàn)出增強(qiáng)的干細(xì)胞特性；與空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，鑒定了新的HSC/MPP“pocket-like”單位(HSC Plus)，它由niche cells(肝母細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)組成，并富含生長(zhǎng)因子。巨噬細(xì)胞在pocket-like單位顯著富集，后續(xù)巨噬細(xì)胞-HSC/MPP共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了巨噬細(xì)胞和生長(zhǎng)因子（MDK，PTN，IGFBP5）對(duì)MSC/MPPs擴(kuò)增起到促進(jìn)作用。人鼠跨物種分析表明，小鼠與人胎肝HSC/MPP之間存在保守的細(xì)胞間互作和擴(kuò)增機(jī)制，但是轉(zhuǎn)錄特征上存在差異。

?具體研究?jī)?nèi)容解析?

1.構(gòu)建小鼠胎肝的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜

作者選擇E11.5至E14.5齡的小鼠胎肝（FL）每隔一天進(jìn)行取樣。為富集HCs和ECs，作者使用熒光分選從胎肝中篩選出HCs、ECS、非造血，非EC細(xì)胞并按一定比例混合進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)質(zhì)控，作者共獲得32449個(gè)細(xì)胞進(jìn)行UMAP降維分析。根據(jù)基因表達(dá)特征，共鑒定到18個(gè)HC細(xì)胞亞群和3個(gè)結(jié)構(gòu)生態(tài)位細(xì)胞亞群，不同的細(xì)胞群均表現(xiàn)出不同的基因表達(dá)特征，且他們的比例與發(fā)育階段動(dòng)態(tài)相關(guān)。隨后，作者通過(guò)對(duì)四個(gè)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞群進(jìn)行差異分析和富集分析，構(gòu)建了胎肝發(fā)育過(guò)程中HSCs/MPPs和結(jié)構(gòu)生態(tài)位細(xì)胞在細(xì)胞組成動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞類(lèi)型特異性基因表達(dá)及階段特異性生物學(xué)功能的整體理解。

Fig?1?發(fā)育中的小鼠FL的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

2.?CD93富集的HSCs/MPPs增強(qiáng)干細(xì)胞特性

為進(jìn)一步剖析HSCs/MPPs的轉(zhuǎn)錄組特征，作者聚焦在HSC/MPP1–3亞群來(lái)探索他們之間的根本差別。通過(guò)對(duì)HSC/MPP1–3亞群進(jìn)行差異基因分析、GO功能富集分析和hscScore干性打分分析，作者發(fā)現(xiàn)相較于HSC/MPP2–3亞群，HSC/MPP1亞群表現(xiàn)出了最強(qiáng)的干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特征。此外，作者發(fā)現(xiàn)HSC/MPP1亞群特異性表達(dá)Cd93。為探究Cd93能否與其他HSC/MPP標(biāo)記物（如Lineage–?Sca-1+c-Kit+(LSK), Flt3–?LSK, and CD150+CD48–?LSK (SLAM-LSK））進(jìn)行組合來(lái)純化具有強(qiáng)大干細(xì)胞特性的HSC/MPP，作者進(jìn)行了隨后的實(shí)驗(yàn)。作者發(fā)現(xiàn)E14.5的Flt3–?LSK細(xì)胞可分為CD93+和CD93-細(xì)胞群，菌落形成單位（CFU）分析表明 CD93+（CD93+LSK,?CD93+Flt3–?LSK, and CD93+SLAM-LSK）細(xì)胞群表現(xiàn)出了更強(qiáng)的菌落形成能力。

Fig?2?CD93富集的HSCs/MPPs具有增強(qiáng)的干細(xì)胞特性

3．整合scRNA-seq和ST解碼HSCs/ MPPs與生態(tài)位細(xì)胞之間的相互作用

作者使用CellPhoneDB構(gòu)建了HSC/MPP-niche cell的相互作用網(wǎng)絡(luò)，并聚焦niche cell與macrophages。除了一些已知的配體-受體關(guān)系對(duì)之外，作者也發(fā)現(xiàn)了一些新的與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞因子識(shí)別、Notch信號(hào)相關(guān)的配體-受體對(duì)。為探究單細(xì)胞所預(yù)測(cè)的信號(hào)相互作用是否確實(shí)存在于解剖學(xué)上的組織細(xì)胞之間，作者對(duì)E14.5時(shí)期的組織制備了10x Visium切片。為了不偏不倚地顯示主要細(xì)胞類(lèi)型的空間組織，作者通過(guò)對(duì)來(lái)自scRNA-seq的細(xì)胞類(lèi)型特征基因的每個(gè)spot分配一個(gè)富集分?jǐn)?shù)來(lái)進(jìn)行反卷積分析，而后根據(jù)前兩種細(xì)胞類(lèi)型的富集分?jǐn)?shù)顯示兩種spot模式(第一模式和第二模式)，然后映射到原FL區(qū)域。與預(yù)期一致，紅細(xì)胞和成肝細(xì)胞在大多數(shù)部位的富集分?jǐn)?shù)最高，表明他們是FL的主要細(xì)胞成分。為了明確HSCs/MPPs及其相互作用的生態(tài)位細(xì)胞的空間組織，作者認(rèn)為spots只是一種可信的細(xì)胞類(lèi)型，如果某種細(xì)胞類(lèi)型超過(guò)閾值（HSC、MPP為80%，niche cell為70%），則將他們映射到原FL區(qū)域，隨后，作者還通過(guò)特異性基因表達(dá)對(duì)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，ST描述了FL的空間組織，以進(jìn)一步解碼由scRNA-seq預(yù)測(cè)的細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用。

Fig 3 整合scRNA-seq和ST解碼HSCs/MPPs和生態(tài)位細(xì)胞之間的相互作用

4．識(shí)別HSCs/MPPs擴(kuò)增單元

為了確定細(xì)胞間相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，作者將HSCs/MPPs spots定義為內(nèi)點(diǎn)（intra）， 內(nèi)點(diǎn)周?chē)蝗pots為近端點(diǎn)（inter）， 其他spots為遠(yuǎn)端點(diǎn)(distant)，然后根據(jù)富集得分來(lái)識(shí)別各個(gè)spots的細(xì)胞類(lèi)型（富集得分最高）。除了HSCs/MPPs外，內(nèi)點(diǎn)得分最高的是EC，與HSCs/MPPs接近；肝母細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分別在近端點(diǎn)和遠(yuǎn)端點(diǎn)中得分最高；巨噬細(xì)胞在內(nèi)點(diǎn)和近端點(diǎn)中的得分高于遠(yuǎn)端點(diǎn)中的得分，因此巨噬細(xì)胞可以考慮是一種新的niche cell。為了量化比較HSCs/MPPs與其他niche cell之間的相互作用?，作者定義了富集倍數(shù)的概念：即每一種spot類(lèi)型富集打分的中位值與全部spots富集打分中位值的比值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞在內(nèi)點(diǎn)的富集倍數(shù)是11.52，在近端點(diǎn)的富集倍數(shù)是1.31；EC在內(nèi)點(diǎn)的富集倍數(shù)是1.62；而肝母細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的富集程度更低 。綜上所述，巨噬細(xì)胞是與HSCs/MPPs關(guān)系最密切的重要生態(tài)位細(xì)胞。

在分子水平，作者使用CellPhoneDB分析來(lái)預(yù)測(cè)相互作用信號(hào)的空間表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些基因編碼的配體基因在內(nèi)點(diǎn)和近端點(diǎn)中高表達(dá)，而對(duì)應(yīng)的受體在HSCs/MPPs定位的spots中高表達(dá)，說(shuō)明空間鄰近促進(jìn)了信號(hào)的相互作用，從而在功能上支持HSCs/MPPs的擴(kuò)增。鑒于內(nèi)點(diǎn)和近端點(diǎn)具有空間臨近和相互作用信號(hào)豐富的特點(diǎn)， 作者將其定義為擴(kuò)增單元，其中HSCs/MPPs位于spots的核心，與周?chē)膎iche cell spots相互作用。

Fig?4 識(shí)別HSCs/MPPs擴(kuò)增單元

5．niche cell在促進(jìn)HSC/MPP擴(kuò)增中的功能驗(yàn)證

為了確定巨噬細(xì)胞在FL中如何調(diào)節(jié)HSC/MPP的擴(kuò)增，作者首先探究了HSCs/MPPs與巨噬細(xì)胞的空間關(guān)系。免疫熒光實(shí)驗(yàn)揭示了兩種空間模式，一種是HSCs/MPPs與巨噬細(xì)胞附著，一種是HSCs/MPPs被巨噬細(xì)胞包圍。后一種模式提示巨噬細(xì)胞可能通過(guò)形成一種“口袋狀”的結(jié)構(gòu)來(lái)促進(jìn)HSC/MPP的擴(kuò)增。通過(guò)HSC/MPP與巨噬細(xì)胞及富含巨噬細(xì)胞衍生物MDK的培養(yǎng)基共培養(yǎng)，作者發(fā)現(xiàn)HSC/MPP擴(kuò)增增強(qiáng)，而巨噬細(xì)胞耗盡則擴(kuò)增減弱。為了確定哪種巨噬細(xì)胞類(lèi)型與HSCs/MPPs密切接觸，作者分別使用了生物信息學(xué)分析、免疫熒光成像和共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究。結(jié)果表明Mac1和Mac2起源于HSCs/MPPs和EMP，在促進(jìn)HSCs/MPPs擴(kuò)增中發(fā)揮了重要作用。

除巨噬細(xì)胞之外，作者還在10x Visium ST結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)皮細(xì)胞與HSCs/MPPs在空間上的緊密聯(lián)系。免疫熒光實(shí)驗(yàn)揭示了HSCs/MPPs被內(nèi)皮細(xì)胞包圍，并且，大部分HSCs/MPPs靠近被EphrinB2標(biāo)記的動(dòng)脈門(mén)血管，少部分靠近被EphB4標(biāo)記的肝靜脈。HSCs/MPPs擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)表明，在IGFBP5-和PTN補(bǔ)充的培養(yǎng)體系中，HSC/MPP的擴(kuò)增更為顯著。

綜上所述，功能分析驗(yàn)證了潛在的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用和潛在的分子機(jī)制支持HSC/MPP擴(kuò)增。

Fig?5 巨噬細(xì)胞促進(jìn)HSC/MPP擴(kuò)增

Fig?6 結(jié)構(gòu)生態(tài)位細(xì)胞促進(jìn)HSC/MPP擴(kuò)增

5．小鼠與人FL血細(xì)胞生成的跨物種分析

為了分析人和小鼠的FL血細(xì)胞生成的保守性和差異，作者對(duì)小鼠FL的單細(xì)胞數(shù)據(jù)與近期發(fā)表的人FL單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較分析。數(shù)據(jù)整合分析和細(xì)胞類(lèi)型鑒定結(jié)果表明，小鼠和人FL之間具有保守的細(xì)胞類(lèi)型和造血分化途徑。為了比較人和小鼠兩個(gè)物種間HSCs/MPPs的轉(zhuǎn)錄組特征，作者分別對(duì)兩個(gè)物種的HSCs/MPPs與其他細(xì)胞群進(jìn)行了差異分析和GO富集分析，結(jié)果表明，兩個(gè)物種間HSCs/MPPs的轉(zhuǎn)錄組特征總體上具有相似性，但對(duì)外界刺激的適應(yīng)性反應(yīng)也存在物種特異性機(jī)制。

Fig 7 鼠與人FL血細(xì)胞生成的跨物種分析

?研究結(jié)論?

文章的研究結(jié)果揭示了HSCs/MPPs的異質(zhì)性、擴(kuò)增的有利因素和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，以及在小鼠和人類(lèi)中保守的擴(kuò)增機(jī)制，為研究HSCs/MPPs的擴(kuò)增提供了寶貴的資源。對(duì)這一資源的進(jìn)一步分析將有助于闡明胎兒起源的血液系統(tǒng)惡性腫瘤的機(jī)制。

?參考文獻(xiàn)?

[1]?Yamamoto, R. et al. Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells. Cell 154, 1112–1126(2013)

[2]?Identification of HSC/MPP expansion units in fetal liver by single-cell spatiotemporal transcriptomics[J]. Cell research.

END

單細(xì)胞生信研發(fā)部? 撰文

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