胃癌(GC)是最常見的癌癥之一，全世界每年有100多萬病例[1]。盡管其存活率在過去40年中顯著增加，但GC仍然是2018年腫瘤死亡的第三大原因[2]。手術(shù)被認(rèn)為是唯一根治胃癌的治療策略，而化療的加入可有效提高胃癌患者的存活率。然而，用于GC治療的傳統(tǒng)化療藥物，如阿霉素(Dox)，副作用嚴(yán)重，患者耐藥性的產(chǎn)生也限制了其臨床應(yīng)用。因此，迫切需要研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，為胃癌的診斷和治療尋找新的靶點(diǎn)。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一組具有獨(dú)特閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性RNA分子，在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中具有多種功能，例如作為microRNA(MiRNA)海綿的功能或作為蛋白質(zhì)合成的模板。在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)circAXIN1通過編碼一種新的致癌蛋白AXIN1-295aa來促進(jìn)GC的發(fā)展。此外，最近的研究報(bào)告了一些circRNA作為蛋白質(zhì)支架來影響兩個(gè)或更多蛋白質(zhì)之間的相互作用。然而，circRNA作為蛋白質(zhì)支架的確切機(jī)制以及circRNA的這種功能如何影響腫瘤的發(fā)生和GC的進(jìn)展仍不清楚。

2022年9月27日，廣東省基因組穩(wěn)定性與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室Yin Peng在Cell Death and Disease上發(fā)表了一篇題為circ_CEA promotes the interaction between the p53 and cyclin-dependent kinases 1 as a scaffold to inhibit the apoptosis of?gastric cancer的文章，在這篇文章中，作者揭示了circ_CEA通過作為蛋白質(zhì)支架并與P53和CDK1蛋白相互作用，保護(hù)GC細(xì)胞免受應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡。靶向circ_CEA與化療藥物聯(lián)合治療可增加腫瘤細(xì)胞的凋亡率，縮小腫瘤體積，減輕化療藥物的副作用。因此，針對(duì)GC治療，靶向circ_CEA可能是一種新的策略。

1、數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)，獲得目的circRNA

作者為了研究在GC中潛在的異常調(diào)節(jié)的circRNA，對(duì)5對(duì)GC和癌旁組織進(jìn)行了高通量circRNA測(cè)序。共鑒定出478個(gè)調(diào)控異常的circRNA，表明這些circRNA可能參與了GC的發(fā)育。隨后進(jìn)一步分析了每對(duì)組織中circRNA的表達(dá)譜，以確定重疊的circRNA。circ_CEA(CircBase ID：HSA_CIRC_0051240)是唯一在所有五對(duì)GC組織中均顯著上調(diào)的circRNA。因此，該circRNA被選中用于進(jìn)一步研究。

2、circRNA表達(dá)研究

作者進(jìn)一步檢測(cè)了circ_CEA在GC組織中的表達(dá)水平。qPCR關(guān)于52例GC和相應(yīng)的癌旁組織分析表明，circ_CEA在GC中顯著上調(diào)。利用GSE152309的基因表達(dá)總集(GEO)數(shù)據(jù)庫中的RNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)circ_CEA和CEA之間的表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，在10例胃組織中，circ_CEA與CEA呈正相關(guān)。綜上所述，circ_CEA可能是影響GC總生存率的不良預(yù)后因素。此外，F(xiàn)ISH結(jié)果顯示，circ_CEA定位于細(xì)胞中的核和胞漿。

3、circRNA表型研究

為了探討circ_CEA在GC發(fā)展中的作用，作者構(gòu)建circ_CEA的過表達(dá)和Simix敲低載體，在體外進(jìn)行了功能分析。EDU分析顯示，circ_CEA基因敲低顯著抑制AGS細(xì)胞的增殖，而circ_CEA過表達(dá)促進(jìn)增殖。此外，劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示，敲低circ_CEA可顯著減少細(xì)胞遷移，過表達(dá)circ_CEA則有相反的結(jié)果。此外，敲低circ_CEA可降低AGS細(xì)胞的克隆形成能力，而過表達(dá)circ_CEA亦有相反的結(jié)果。

為了研究circ_CEA在應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用，將過表達(dá)和敲低circ_CEA的AGS細(xì)胞置于血清饑餓中72小時(shí)，然后用Annexin V/PI染色通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。敲低circ_CEA可增加血清饑餓誘導(dǎo)的早期細(xì)胞凋亡，circ_CEA過表達(dá)則有相反的結(jié)果。

4、circ_CEA與P53和CDK1蛋白相互作用

接下來，作者研究了circ_CEA抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的GC細(xì)胞凋亡的機(jī)制。推測(cè)circ_CEA可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)或與這些蛋白相互作用而參與細(xì)胞凋亡。為了識(shí)別與circ_CEA相互作用的潛在蛋白質(zhì)，我們進(jìn)行了基于MS2/MS2-CP的RNA下拉試驗(yàn)。收集沉淀產(chǎn)物，進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析。KEGG分析表明，這些蛋白質(zhì)主要與內(nèi)吞作用、剪接體、細(xì)胞周期和p53信號(hào)通路有關(guān)。

在這些蛋白中，與P53信號(hào)通路相關(guān)的P53和CDK1引起了人們的關(guān)注。P53在各種應(yīng)激刺激下被激活，并通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而起到抑制腫瘤的作用。為了進(jìn)一步證實(shí)circ_CEA是否與p53和CDK1蛋白相互作用，在293T和AGS細(xì)胞中進(jìn)行了RIP檢測(cè)。作者還研究了circ_CEA和FOXO_3之間的相互作用，F(xiàn)OXO_3是參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子。在有或不有circ_CEA過表達(dá)的293T細(xì)胞中，抗P53抗體共沉淀了circ_CEA。在轉(zhuǎn)染circ_CEA表達(dá)載體的293T細(xì)胞中，抗CDK1或FOXO_3抗體也可共沉淀。與293T細(xì)胞的研究結(jié)果一致，在轉(zhuǎn)circ_CEA表達(dá)載體的AGS細(xì)胞中，抗P53、CDK1和FOXO_3抗體共沉淀了circ_CEA。進(jìn)一步，利用生物素標(biāo)記的針對(duì)circ_CEA連接位點(diǎn)的寡核苷酸探針，對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行了CIRCCEA表達(dá)載體的RNA下拉檢測(cè)。與對(duì)照探針相比，circ_CEA探針沉淀了更高水平的p-p53 ser315、p53、CDK1和FOX03蛋白。CDK1是Ser/Thr蛋白激酶家族中的一員，已被報(bào)道在Ser315處介導(dǎo)P53的磷酸化。進(jìn)一步，用circ_CEA探針和抗P53抗體在AGS細(xì)胞中進(jìn)行FISH分析，證實(shí)了circ_CEA和P53的共存。這些結(jié)果表明，circ_CEA與P53、CDK1和FOXO_3蛋白相互作用。

5、circ_CEA促進(jìn)CDK1介導(dǎo)的P53在Ser315位的磷酸化并抑制P53在胃癌中的活性

CDK1誘導(dǎo)的SER315處的P53磷酸化，降低了P53的穩(wěn)定性并抑制了P53的功能。由于作者已經(jīng)證明circ_CEA促進(jìn)CDK1和P53蛋白之間的相互作用，接下來就研究了circ_CEA是否影響SER315處的P53磷酸化。用1.25μM的Dox處理siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的AGS細(xì)胞一段時(shí)間后，用Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。circ_CEA下調(diào)顯著降低p-P53 ser315水平，但不影響總P53水平。

6、下調(diào)circ_CEA抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡與胃癌肺轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究

為了研究circ_CEA對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響，我們將AGS細(xì)胞注射到BALB/c裸鼠體內(nèi)，建立了皮下移植瘤模型。然后將這些小鼠隨機(jī)分為4組：1.對(duì)照組、2.circ_CEA Simix敲低組、3.Dox組和4.Simix+Dox組。與對(duì)照組相比，circ_CEA Simix或Dox單獨(dú)給藥抑制腫瘤生長(zhǎng)，而它們聯(lián)合給藥的抑制效果明顯更明顯。

qPCR分析證實(shí)，circ_CEA siRNA注射后，circ_CEA在體內(nèi)的表達(dá)明顯受到抑制。接下來，TUNEL分析顯示，單獨(dú)給予circ_CEA siRNA或Dox誘導(dǎo)皮下移植瘤中等程度的凋亡，而聯(lián)合給予進(jìn)一步促進(jìn)凋亡。qPCR分析顯示，circ_CEA Simix誘導(dǎo)P53促凋亡靶基因noxA、Puma、Fas、Bax和FOX03靶基因Bim顯著上調(diào)。提示circ_CEA基因敲低可抑制腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與體內(nèi)調(diào)控P53靶基因表達(dá)有關(guān)。

與對(duì)照組相比，Dox或circ_CEA Simix單獨(dú)給藥顯著減少了肺部轉(zhuǎn)移灶，而聯(lián)合給藥對(duì)肺轉(zhuǎn)移的抑制作用明顯更大。此外，服用Dox或Dox+Simix的小鼠體重明顯低于對(duì)照組或circ_CEA Simix組。對(duì)照組和circ_CEA Simix組小鼠體重?zé)o顯著差異，表明circ_CEA Simix給藥沒有引起嚴(yán)重的副作用。在治療癌癥患者時(shí)，化療毒性是一個(gè)主要問題?；熕幬锱ccirc_CEA siRNA聯(lián)合治療可降低毒副作用，提高療效。研究結(jié)果表明，circ_CEA下調(diào)可減少體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移。聯(lián)合應(yīng)用circ_CEA、siRNA和Dox對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移有協(xié)同抑制作用。

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41419-022-05254-1

參考文獻(xiàn)：

[1]Rawla P, Barsouk A. Epidemiology of gastric cancer: global trends, risk factors and prevention. Prz Gastroenterol. 2019;14:26–38

[2]Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2018;68:394–424.