近年來(lái)，隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展， 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組在研究中應(yīng)用越來(lái)越多，而過(guò)去多年來(lái)，公共數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)積累也非常可觀，如批量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)等，因此在科學(xué)研究中，在已有單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的情況下，如何有效聯(lián)合公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)來(lái)闡述相關(guān)科學(xué)問(wèn)題是一個(gè)值得探討的話題。

我們今天將對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘的常見(jiàn)思路進(jìn)行簡(jiǎn)單的匯總，供大家參考。

研究思路一

利用scRNA-Seq數(shù)據(jù)指導(dǎo)批量RNA-seq數(shù)據(jù)的挖掘

1.scRNA-Seq揭示了炎癥性癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞在膀胱尿路上皮癌中的作用

在2020年發(fā)表的一篇研究膀胱尿路上皮癌的文章中，作者對(duì)8個(gè)膀胱癌（BC）腫瘤樣本與3 個(gè)癌旁樣本（para tumor samples）進(jìn)行scRNA-Seq，并在BC微環(huán)境中鑒定了19種不同的細(xì)胞類(lèi)型，表明高腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。文章發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中MHC-II分子下調(diào)，表明腫瘤細(xì)胞的免疫原性下調(diào)可能有助于形成免疫抑制微環(huán)境。文章還發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞在腫瘤區(qū)域進(jìn)行M2極化并分化。

此外，LAMP3+DC細(xì)胞亞群可能能夠募集調(diào)節(jié)T細(xì)胞，參與腫瘤微環(huán)境免疫抑制的形成。通過(guò)結(jié)合公共數(shù)據(jù)集中的3000多個(gè)BC批量RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，文章確定了炎癥性癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞（ICAFs）在腫瘤進(jìn)展中的作用，ICAFs與預(yù)后不良顯著相關(guān)。此外，文章還根據(jù)ICAFs建立了一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這些結(jié)果可以幫助闡明ICAF的原始機(jī)制，為腫瘤免疫學(xué)提供了深刻的見(jiàn)解，并為未來(lái)的藥物發(fā)現(xiàn)提供了重要的資源。

文章以scRNA-Seq為參考數(shù)據(jù)集，使用CIBERSORTx對(duì)3000多膀胱癌的批量測(cè)序數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)反卷積，預(yù)測(cè)獲取了每個(gè)TCGA樣本的細(xì)胞類(lèi)型豐度。以細(xì)胞類(lèi)型豐度的50%占比為標(biāo)準(zhǔn)，將樣本分為某種細(xì)胞類(lèi)型高表達(dá)或低表達(dá)。使用多因素COX回歸分析，計(jì)算TCGA 數(shù)據(jù)中相對(duì)細(xì)胞豐度與患者生存的相關(guān)性，篩選感興趣的細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行Kaplan-Meier法生存分析。結(jié)合TCGA分子亞型劃分，識(shí)別細(xì)胞豐度改變，最后文章以同樣的方法在microarray數(shù)據(jù)中也進(jìn)行了驗(yàn)證。

2.基于腫瘤scRNA-Seq與批量RNA-seq的貝葉斯整合分析-BayesPrism軟件對(duì)細(xì)胞類(lèi)型和基因表達(dá)進(jìn)行反卷積

以往使用scRNA-Seq數(shù)據(jù)反卷積bulk數(shù)據(jù)的方法主要為CIBERSORTx，然而CIBERSORTx目前僅有在線工具，需要教育郵箱注冊(cè)上傳數(shù)據(jù)，且個(gè)人分析空間有限，很受數(shù)據(jù)量大小與國(guó)內(nèi)網(wǎng)速影響。于2022年發(fā)表在《Nature Cancer》上的BayesPrism軟件，是一種本地化工具，可將scRNA-Seq數(shù)據(jù)作為先驗(yàn)信息來(lái)預(yù)測(cè)來(lái)批量RNA-Seq中細(xì)胞類(lèi)型的組成和基因表達(dá)。

在該文章中，作者對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）和皮膚黑色素瘤（SKCM）進(jìn)行了分析，以將細(xì)胞類(lèi)型組成與不同腫瘤類(lèi)型的臨床結(jié)果相關(guān)聯(lián)，探索惡性和非惡性細(xì)胞狀態(tài)的空間異質(zhì)性。

研究思路二

基于批量RNA-seq數(shù)據(jù)輔助scRNA-seq數(shù)據(jù)細(xì)胞類(lèi)型鑒定

1.通過(guò)整合批量RNA-seq和scRNA-seq數(shù)據(jù)來(lái)識(shí)別與表型相關(guān)的亞群

單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）可以區(qū)分異質(zhì)組織中的細(xì)胞類(lèi)型、狀態(tài)和譜系。然而，目前的單細(xì)胞數(shù)據(jù)不能直接將細(xì)胞群體與特定的表型聯(lián)系起來(lái)。比如，對(duì)于單細(xì)胞中的惡性細(xì)胞可用infercnv識(shí)別，但是在癌癥和非癌癥疾病中，除了腫瘤與正常之外，還有各種各樣的外部表型，如治療抵抗、疾病分期、生存結(jié)果和年齡，這些都可以通過(guò)批量RNA-seq數(shù)據(jù)廣泛獲得，但是難以直接通過(guò)單細(xì)胞數(shù)據(jù)本身推測(cè)。

于2022年發(fā)表在Nature Biotechnology上的一篇算法文章中，作者針對(duì)以上問(wèn)題，開(kāi)發(fā)了Scissor算法。Scissor利用批量RNA-seq數(shù)據(jù)中的表型信息來(lái)識(shí)別與表型最高度相關(guān)的細(xì)胞亞群。Scissor不需要對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行任何無(wú)監(jiān)督的聚類(lèi)，避免了對(duì)細(xì)胞簇?cái)?shù)或聚類(lèi)分辨率的主觀決定的影響。

Scissor提供了一個(gè)靈活的框架來(lái)整合批量RNA-seq數(shù)據(jù)中的各種外部表型，以指導(dǎo)單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析，使臨床和生物意義相關(guān)的細(xì)胞亞群能夠在沒(méi)有假設(shè)的情況下進(jìn)行識(shí)別：

(1)識(shí)別腫瘤細(xì)胞。以TCGA肺腺癌為參考數(shù)據(jù)集，生存時(shí)間為表型信息，Scissor在單細(xì)胞數(shù)據(jù)中識(shí)別一個(gè)有侵襲性腫瘤細(xì)胞的亞群，該亞群與較差的預(yù)后相關(guān)，并表征為低氧相關(guān)基因的過(guò)表達(dá)，據(jù)此文章推測(cè)：低氧活性推動(dòng)肺腺癌的進(jìn)展;

(2)識(shí)別免疫治療相關(guān)的T細(xì)胞亞群。以黑色素瘤為參考數(shù)據(jù)集，免疫治療效果為表型信息，Scissor在單細(xì)胞數(shù)據(jù)中識(shí)別了105個(gè)T細(xì)胞為Scissor+細(xì)胞，它們與良好的免疫治療反應(yīng)相關(guān);

(3)識(shí)別Alzheimer's相關(guān)細(xì)胞亞群。以7個(gè)AD患者，7個(gè)正常對(duì)照為參考數(shù)據(jù)集，Scissor在7432少突膠質(zhì)細(xì)胞中識(shí)別206個(gè)AD陽(yáng)性細(xì)胞，104個(gè)normal陽(yáng)性細(xì)胞。在1078個(gè)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞中識(shí)別20個(gè)AD陽(yáng)性，201個(gè)normal陽(yáng)性細(xì)胞；在2171個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞中識(shí)別179個(gè)AD陽(yáng)性與14個(gè)nomal陽(yáng)性。

2.通過(guò)整合批量RNA-seq，來(lái)識(shí)別與胃腺癌惡性腫瘤細(xì)胞

于2021年發(fā)表在Gut上的一篇研究胃腺癌的文章中，作者對(duì)9個(gè)腫瘤和3個(gè)非腫瘤樣本的27677個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq測(cè)序，并使用大規(guī)模組織學(xué)分析和bulk轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)集對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。在對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)胞類(lèi)型注釋后，文章選取上皮細(xì)胞（4776個(gè)）進(jìn)行惡性與非惡性細(xì)胞區(qū)分。文章使用常規(guī)的CNV進(jìn)行區(qū)分，4/4776的假定非惡性細(xì)胞顯示異常的CNV信號(hào)，然而只有25.0%的假定惡性細(xì)胞表現(xiàn)出高水平的CNV。這一結(jié)果得到TCGA的驗(yàn)證，即：大部分原發(fā)性胃腺癌樣本經(jīng)全外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)CNV信號(hào)較低，使用CNV難以區(qū)分上皮細(xì)胞的惡性與非惡性。

因此，文章通過(guò)使用TCGA 腫瘤與癌旁的批量RNA-seq數(shù)據(jù)集，進(jìn)行l(wèi)imma差異基因篩選，獲取Top50腫瘤特異性高表達(dá)基因與Top50正常組織特異性高表達(dá)基因?qū)渭?xì)胞上皮細(xì)胞類(lèi)型打分（addmodulescore）,并對(duì)這兩列打分結(jié)果使用K-means聚為初始潛在惡性與初始潛在非惡性細(xì)胞。由于TCGA bulk的初始識(shí)別因含有非上皮細(xì)胞而產(chǎn)生偏差，文章又重計(jì)算兩類(lèi)上皮之間的差異基因，依然用Top50惡性細(xì)胞特異性高表達(dá)基因與Top50非惡性細(xì)胞特異性高表達(dá)基因?qū)λ猩掀ぜ?xì)胞打分，根據(jù)此打分重聚類(lèi)。該重聚類(lèi)結(jié)果與上一次聚類(lèi)結(jié)果做比較（比如同一聚類(lèi)簇中barcodes重疊占比），若聚類(lèi)結(jié)果相差較大則重復(fù)打分聚類(lèi)步驟，直到聚類(lèi)結(jié)果趨于穩(wěn)定（比如多次聚類(lèi)，同類(lèi)型簇中barcodes重疊率達(dá)90%以上）。使用該方法，文章鑒定出5635個(gè)惡性上皮細(xì)胞和4776個(gè)非惡性上皮細(xì)胞。后續(xù)對(duì)此聚類(lèi)著色作圖，差異基因富集，都驗(yàn)證了該方法結(jié)果的準(zhǔn)確性。

研究思路三

基于藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)對(duì)scRNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋

scRNA-seq揭示了新生兒室管膜瘤的細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)和異常發(fā)育軌跡

室管膜瘤是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的異質(zhì)性實(shí)體瘤。于2022年發(fā)表在Cancer Cell上的一篇研究室管膜瘤的文章中，作者應(yīng)用scRNA-Seq來(lái)分析不同分子類(lèi)群和解剖位置之間的室管膜瘤，以調(diào)查它們?cè)谀[瘤內(nèi)的異質(zhì)性和發(fā)展源頭。室管膜瘤由起源于未分化群體的細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)組成，這些細(xì)胞群體經(jīng)歷了三種向神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)命運(yùn)譜系分化受損的過(guò)程。預(yù)后良好的室管膜瘤細(xì)胞亞型主要含有高度分化細(xì)胞，而侵襲性細(xì)胞亞型則存在更多的未分化細(xì)胞群。文章描述的轉(zhuǎn)錄特征與患者生存相關(guān)，并定義了靶向治療方法的分子依賴(lài)性。

文章進(jìn)一步使用infercnv篩選惡性細(xì)胞，對(duì)惡性細(xì)胞進(jìn)行非負(fù)矩陣分解（NMF），并以NMF所得的9個(gè)元模塊對(duì)細(xì)胞打分，以最高分注釋細(xì)胞類(lèi)型。使用分別有高低分化水平的PF-Ependymal-like和PF-Neuronal-Precursor-like 結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)預(yù)后，發(fā)現(xiàn)高分化水平有較好預(yù)后，而低分化水平則相反。選取兩個(gè)低分化水平的模塊：PF-Neuronal-Precursor-like和FC-NSC-like。對(duì)PF-Neuronal-Precursor-like與藥物基因互作數(shù)據(jù)庫(kù)（DGIdb）進(jìn)行整合，使用數(shù)據(jù)庫(kù)信息注釋模塊中基因，并顯示了”Druggable genome“ 和 “Clinically actionable”相關(guān)基因。對(duì)模塊與數(shù)據(jù)庫(kù)交集基因進(jìn)行富集與通路分析，明確被注釋基因的生物學(xué)功能。這些藥物干預(yù)的靶基因可作為后續(xù)用藥的指導(dǎo)與預(yù)測(cè)。

研究思路四

結(jié)合疾病相關(guān)基因集探尋病理

單細(xì)胞分辨率下人類(lèi)腸道發(fā)育的時(shí)空分析

先天性腸道疾病的發(fā)病機(jī)制仍不明確，因?yàn)榛A(chǔ)遺傳缺陷的疾病較為稀少，并且有許多發(fā)生在胎兒尚在子宮中的早期。為了揭示可能導(dǎo)致先天性腸道疾病發(fā)育時(shí)間特異性的轉(zhuǎn)錄缺陷，文章將自身單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與人類(lèi)表型本體論數(shù)據(jù)庫(kù)（Human Phenotype Ontology ，HPO）中用遺傳表型注釋的圍產(chǎn)期腸道疾病的列表進(jìn)行了關(guān)聯(lián)，探尋先天性腸道疾病的發(fā)病機(jī)制。文章篩選749個(gè)腸道疾病相關(guān)基因，其中718個(gè)在文章數(shù)據(jù)中表達(dá)。使用AUCELL計(jì)算每一個(gè)基因集在數(shù)據(jù)中的評(píng)分，每一個(gè)細(xì)胞都將獲得對(duì)應(yīng)打分的基因集與其對(duì)應(yīng)的AUC值。對(duì)每一個(gè)基因集在cluster(可以是組織類(lèi)型注釋?zhuān)?xì)胞類(lèi)型注釋?zhuān)瑫r(shí)間注釋等等)下做AUCell.AUC>0.8則該基因?yàn)榧?xì)胞類(lèi)型特異性的。該基因缺陷則可導(dǎo)致相應(yīng)疾病。對(duì)篩選出的特異性基因基于發(fā)育時(shí)間點(diǎn)做差異表達(dá)，則可篩選出發(fā)育時(shí)間特異性基因。

研究思路五

利用公共數(shù)據(jù)集驗(yàn)證細(xì)胞類(lèi)型存在

內(nèi)皮細(xì)胞的onco-fetal重編程驅(qū)動(dòng)肝細(xì)胞癌中的免疫抑制巨噬細(xì)胞

長(zhǎng)久以來(lái)，樣本量不足一直是個(gè)困擾研究者的問(wèn)題，在此基礎(chǔ)上的發(fā)現(xiàn)，也會(huì)因此而遭受質(zhì)疑。除了聯(lián)合bulk數(shù)據(jù)與臨床驗(yàn)證外，使用已發(fā)表的單細(xì)胞數(shù)據(jù)驗(yàn)證也是很好的策略。

文章發(fā)現(xiàn)了內(nèi)皮重編程驅(qū)動(dòng)的腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞（TAM）類(lèi)群，但是TAM有可能是單核細(xì)胞來(lái)源的，也有可能是胚胎駐留的，且胚胎組織駐留巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞來(lái)源巨噬缺乏可靠marker進(jìn)行區(qū)分。因此文章作者團(tuán)隊(duì)培育Ms4a3Cre-RosaTdT小鼠（RNA-Seq測(cè)序），用以區(qū)分胚胎駐留（Tomato– )和單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞(Tomato +)。以腫瘤中單核吞噬細(xì)胞（mononuclear phagocytes，MNPs）為訓(xùn)練集，以胎肝，轉(zhuǎn)基因小鼠肝為測(cè)試集。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因小鼠embryonically macro（ Tomato–）與腫瘤TAM1有高度關(guān)聯(lián)；胎肝巨噬細(xì)胞（FLM）與腫瘤TAM1有高度關(guān)聯(lián)。這證明TAMs中的確有細(xì)胞類(lèi)群經(jīng)歷了胚胎式重編程。

總結(jié)

今天我們就單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘的常見(jiàn)分析思路進(jìn)行了匯總，現(xiàn)在我們來(lái)做一下簡(jiǎn)單回顧，主要包含5個(gè)方面：

（1）基于scRNA-Seq數(shù)據(jù)，指導(dǎo)批量RNA-seq數(shù)據(jù)的挖掘，以獲得批量RNA-seq數(shù)據(jù)中包含的更多的潛在信息；

（2）基于批量RNA-seq數(shù)據(jù)，結(jié)合臨床信息，輔助對(duì)scRNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)胞類(lèi)型注釋?zhuān)沟媒Y(jié)果更為可信，更具臨床價(jià)值；

（3）結(jié)合藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)，有利于指導(dǎo)、預(yù)測(cè)后期試驗(yàn)用藥與藥效，推進(jìn)“老藥新用”等測(cè)試方案；

（4）對(duì)于發(fā)病機(jī)制仍不明確的疾病，結(jié)合疾病相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫(kù)可探尋個(gè)體發(fā)育、疾病發(fā)展過(guò)程中基因失調(diào)機(jī)制，從而揭示轉(zhuǎn)錄缺陷；

（5）利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)通過(guò)現(xiàn)有scRNA-Seq數(shù)據(jù)鑒定的細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行驗(yàn)證。

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