前言

炎癥是衰老的普遍特征，在組織功能障礙中，先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞發(fā)揮重要作用。在大腦中，小膠質(zhì)細(xì)胞是常駐的多功能免疫細(xì)胞。在老年和神經(jīng)退行性大腦中，疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出衰竭特征。

衰老是響應(yīng)壓力和組織老化的細(xì)胞命運(yùn)保守機(jī)制。它在許多細(xì)胞類型和環(huán)境中表現(xiàn)出異質(zhì)性，其特征是大分子和細(xì)胞器損傷、細(xì)胞周期停滯、衰老相關(guān)分泌表型 (SASP) 的產(chǎn)生。

本篇由梅奧診所羅伯特和阿琳·科戈德衰老研究中心研究團(tuán)隊在Nature Communications期刊（IF:17.694）發(fā)表了題為 “Rejuvenation of the aged brain immune cell landscape in mice through p16-positive senescent cell clearance”的研究成果，采用NanoString nCounter、單細(xì)胞測序技術(shù)，CyTOF等研究方法，發(fā)現(xiàn)了衰老小鼠大腦中衰老細(xì)胞的特性。表明衰老和炎癥表達(dá)譜隨著年齡的增長而增加，并且是大腦區(qū)域和性別特異性的。通過雌性p16-InkAttac小鼠p16 陽性衰老細(xì)胞清除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)衰老指標(biāo)部分恢復(fù)到年輕水平，揭示了衰老過程中大腦免疫細(xì)胞宏觀的動態(tài)重塑，提示將靶向衰老細(xì)胞作為對抗炎癥變化和認(rèn)知能力下降的策略。

研究背景

作者假設(shè) p16 相關(guān)的衰老機(jī)制可能調(diào)節(jié)與年齡相關(guān)的腦功能障礙，p16 陽性衰老小膠質(zhì)細(xì)胞在新興腦免疫中的分子特性以及全身細(xì)胞衰老在調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)腦炎癥中的機(jī)制作用尚未見報道。此外，盡管衰老細(xì)胞及其 SASP 被認(rèn)為是與年齡相關(guān)的組織炎癥的驅(qū)動因素，但它們的靶向是否以及如何重塑受年齡影響的組織（包括大腦）中的免疫細(xì)胞組成尚不清楚。

本文作者利用單細(xì)胞技術(shù)、特定區(qū)域的轉(zhuǎn)錄分析技術(shù)、熒光成像和行為實(shí)驗(yàn)來研究晚年認(rèn)知變化背景下與年齡和性別相關(guān)的穩(wěn)態(tài)腦細(xì)胞衰老和炎癥。研究結(jié)果揭示了在不同性別的細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄水平上，大腦炎癥激活譜存在顯著的與年齡相關(guān)的多樣性。通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，作者證明了衰老的腦髓細(xì)胞的特征在于驅(qū)動外周免疫細(xì)胞趨化性的 SASP。重要的是，作者表明系統(tǒng)性靶向 p16 陽性衰老細(xì)胞可以部分恢復(fù)腦免疫細(xì)胞組成，改善認(rèn)知功能。

研究思路

研究結(jié)論

1.衰老和炎癥基因在不同性別和大腦區(qū)域的老年小鼠大腦中異上調(diào)

為了探索年齡對炎癥穩(wěn)態(tài)和衰老的影響，作者使用 NanoString nCounter 技術(shù)對海馬、腦室下區(qū)等區(qū)分析了 800 個炎癥和衰老相關(guān)基因的表達(dá)模式。6月大（年輕）與 24 個月大（年老）雌性和雄性小鼠。在雌性中，作者確定了 274 個受年齡影響的差異表達(dá)基因（圖 1a）。在雄性中，作者確定了 141 個受年齡影響的基因（圖 1a ）。15 個保守基因隨著年齡和性別的增加而增加（圖 1b）。接下來，研究了性別之間保守且不同的年齡和區(qū)域特異性表達(dá)模式，并確定了在單個大腦區(qū)域和性別中唯一差異表達(dá)的基因（圖1a，c-e）。海馬中的年齡依賴性表達(dá)譜似乎在兩性之間最明顯（圖 1c）。對于腦室下區(qū)和小腦，雄性與雌性共享大部分差異表達(dá)的基因，在雄性中未發(fā)現(xiàn)更大比例的雌性年齡改變基因（圖 1d，e）。

由于不同的衰老特征描述了不同性別和大腦區(qū)域，作者接下來考慮了所有年輕與老年基因的比較，以進(jìn)行獨(dú)創(chuàng)性途徑分析（IPA）（圖 1f）。作者觀察到炎癥通路呈現(xiàn)年齡依賴性增加，突觸傳遞通路卻減少，此外也發(fā)現(xiàn)特定通路在大腦區(qū)域和性別之間受到明顯調(diào)節(jié)。因此，與年齡相關(guān)的衰老和炎癥基因明顯地表征了跨性別和大腦區(qū)域下的衰老大腦。

圖1 | 衰老和炎癥的基因在不同性別和大腦區(qū)域的老年小鼠大腦中受到不同的調(diào)節(jié)

2.p16 陽性衰老的腦髓細(xì)胞表現(xiàn)出SASP、MHC、溶酶體和穩(wěn)態(tài)功能改變的標(biāo)志

接下來，作者使用單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 在年輕和年老小鼠大腦中鑒定衰老細(xì)胞，重點(diǎn)關(guān)注雌性，因?yàn)樗鼈兣c衰老相關(guān)的轉(zhuǎn)錄特征更明顯（圖1）。使用 10X 基于液滴的方法，作者從兩個年輕和四個老年的腦單細(xì)胞懸液中回收了 6385 個細(xì)胞。使用 Seurat 分析流程，作者確定了六個不同的細(xì)胞簇（圖 2a），這些細(xì)胞簇包括星形膠質(zhì)細(xì)胞 ( Aldoc )、神經(jīng)元 ( Snap25 )、少突膠質(zhì)細(xì)胞 ( Mbp ), 骨髓細(xì)胞 ( Cx3cr1）、內(nèi)皮細(xì)胞（Pecam1）和室管膜細(xì)胞（ Calml4）（圖 2b）。

基于作者對衰老效應(yīng)因子 Cdkn2a/p16 Ink4a在老年女性大腦中上調(diào)的大量基因表達(dá)觀察，作者在特定細(xì)胞簇中搜索了Cdkn2a轉(zhuǎn)錄水平。骨髓細(xì)胞含有最高頻率的Cdkn2a陽性細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞群含有較少的Cdkn2a陽性細(xì)胞（圖 2c）。鑒于Cdkn2a信號的顯著豐度，作者對骨髓簇進(jìn)行了無偏連續(xù)聚類，并確定了一個富含Cdkn2a陽性細(xì)胞的單細(xì)胞群（圖 2d，e ），隨著年齡的增長而增加（圖 2f）。基因集富集分析（GSEA）揭示了溶酶體功能的下調(diào)和趨化因子信號傳導(dǎo)、核糖體功能和阿爾茨海默病的上調(diào)（圖 2g、h）。

為了驗(yàn)證小膠質(zhì)細(xì)胞對衰老大腦中衰老髓系細(xì)胞區(qū)室的貢獻(xiàn)，作者分析了先前發(fā)表的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)。對應(yīng)于 8 個年輕（2-3 個月）和 8 個老年（21-23 個月）小鼠腦單細(xì)胞懸液，小膠質(zhì)細(xì)胞群之一包含最高頻率的Cdkn2a陽性細(xì)胞，與骨髓簇 2 的基因表達(dá)譜（圖 2g）顯著一致。GSEA 揭示了與髓細(xì)胞簇 2 相似的功能評估（圖 2h），累積地，兩個獨(dú)立的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集揭示了一個腦小膠質(zhì)細(xì)胞群作為Cdkn2a/p16 Ink4a在老腦中的陽性群，其特征在于衰老和 DAM/WAM 激活的重疊基因特征。

圖2 | 單細(xì)胞 RNA 測序揭示了一個與年齡相關(guān)的Cdkn2a/p16 Ink4a陽性衰老髓系腦細(xì)胞群

3.p16 陽性衰老骨髓細(xì)胞在老年女性齒狀回中積聚

接下來探討了p16-InkAttac小鼠年輕和年老大腦中 p16 陽性骨髓細(xì)胞的特性和豐度，這些小鼠系統(tǒng)地消除了 p16 陽性細(xì)胞。作者使用 RNA 原位雜交和 IF 成像檢測細(xì)胞的標(biāo)志物?；谕ㄟ^ scRNA-seq轉(zhuǎn)錄特征，鑒定出p16 Ink4a +IBA1+ 細(xì)胞，其趨向于比年輕雌性小鼠豐富。

基于作者觀察到老年大腦中p16陽性衰老髓細(xì)胞上調(diào)趨化 SASP 因子，作者設(shè)計了一個體外模型來測試衰老腦髓細(xì)胞的 SASP 是否驅(qū)動外周免疫細(xì)胞趨化性。在兩周內(nèi)將原代小鼠腦骨髓細(xì)胞暴露于 10 Gy X 射線照射（IR）誘導(dǎo)的衰老（圖 3a，b）。具體來說，71% 的 IR 暴露的腦髓細(xì)胞對溶酶體應(yīng)激標(biāo)記物 SA-β-gal 呈陽性（圖 3a）。在暴露于 IR 的培養(yǎng)物中，RT-PCR 基因表達(dá)譜顯示衰老效應(yīng)子p16 Ink4a和 SASP 因子顯著增加。對分泌蛋白的分析顯示，已建立和/或趨化 SASP 因子顯著增加，包括 GDF15、CCL2/MCP1、CCL3/MIP1a和 TNFRSF1A。相對于假對照培養(yǎng)基，衰老的 IR 暴露培養(yǎng)物的培養(yǎng)基（圖 3b）。

體外衰老腦髓細(xì)胞培養(yǎng)物與 scRNA-seq 結(jié)果的比較表明p16 Ink4a、MHC II 組分、CCL2、CCL3 和 CCL4 的共同上調(diào)，表明體外模型概括了體內(nèi)衰老腦的關(guān)鍵趨化特征。作者還注意到模型差異，包括體內(nèi)Spp1的上調(diào)和衰老骨髓培養(yǎng)基Spp下調(diào)（圖3b）。作者接下來使用微流體遷移室系統(tǒng)測定衰老的腦髓樣 SASP 是否化學(xué)吸引外周免疫細(xì)胞（圖 3c）。由 T 和 B 淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞組成的 GFP 陽性脾細(xì)胞優(yōu)先向含有 SASP 蛋白的衰老培養(yǎng)基遷移（圖 3d）。因此，衰老腦髓細(xì)胞的 SASP 驅(qū)動外周免疫細(xì)胞趨化。

圖3 | 衰老的腦髓細(xì)胞分泌一種 SASP，可促進(jìn)體外外周免疫細(xì)胞募集

4.通過 p16 陽性衰老細(xì)胞的全身靶向而減少激活的常駐浸潤免疫細(xì)胞在老年大腦中積聚

接下來，作者進(jìn)行了質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)來研究腦免疫細(xì)胞組成中與年齡相關(guān)的變化，并測試 p16 陽性衰老細(xì)胞的全身靶向是否會降低浸潤性免疫細(xì)胞的豐度。20 種免疫標(biāo)志物用于研究年輕與年老雌性和雄性p16-InkAttac小鼠腦細(xì)胞區(qū)室中的總 CD45+細(xì)胞。

根據(jù)類型和狀態(tài)標(biāo)記進(jìn)一步分離七個集群，共 19 個不同的群體（圖 4a）。在老年女性中，作者觀察到 CD45+CD11b+CX3CR1 hi '穩(wěn)態(tài)'小膠質(zhì)細(xì)胞的頻率顯著降低，這是最豐富的 CD45+ 群體（圖 4b）。與年齡相關(guān)的穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞減少伴隨著活化的常駐小膠質(zhì)細(xì)胞和浸潤免疫細(xì)胞的擴(kuò)張。在男性和女性中，作者觀察到兩個活化的小膠質(zhì)細(xì)胞群的頻率隨年齡增長而增加（圖 4c）和（圖 4d）。額外的小膠質(zhì)細(xì)胞群在老年女性中的頻率增加（圖 4e）。

作者確定了三個共同表達(dá) CD206 和 CD38 的群體（圖 4f-h）。漿細(xì)胞樣DC群體在老年女性腦中的頻率增加（圖 4j）。Ly6C+ 單核細(xì)胞群體（圖 4k-m）和中性粒細(xì)胞群體（圖 4n），它們顯示出雌性的變異性。腦單核細(xì)胞在老年男性中增加（圖4l )。CENPB 和 p21 是以前用于鑒定衰老細(xì)胞的標(biāo)志物，在此鑒定了獨(dú)特的單核細(xì)胞群（圖 4m），表明在衰老女性大腦中的浸潤性免疫群體在衰老細(xì)胞清除后恢復(fù)到年輕水平（圖 4p）。所有 T 細(xì)胞群在老年女性大腦中增加，兩個在老年男性大腦中增加（圖 4q-t）。

作者的大規(guī)模細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，與男性相比，老年大腦與年輕大腦中的炎癥細(xì)胞發(fā)生了動態(tài)重塑，激活的常駐小膠質(zhì)細(xì)胞和浸潤的免疫細(xì)胞區(qū)室，并在老年女性中更為明顯。系統(tǒng)性靶向 p16 陽性衰老細(xì)胞的 AP 治療顯著降低了共表達(dá) MHCII 和 CD11c 的小膠質(zhì)細(xì)胞群（圖 4e）的豐度，轉(zhuǎn)基因衰老細(xì)胞靶向還減弱了浸潤免疫群體（包括 B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞）的年齡依賴性增加。

圖4 | 質(zhì)譜流式顯示老年大腦中激活的常駐和浸潤免疫細(xì)胞的頻率增加，而系統(tǒng)性靶向女性 p16 陽性衰老細(xì)胞可減少這些細(xì)胞的頻率

5. 在 p16 陽性衰老細(xì)胞靶向后，認(rèn)知功能得以保留，并且與老年雌性小鼠中大量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和浸潤腦免疫群體有關(guān)

年老的雌性和雄性小鼠認(rèn)知功能的指標(biāo)明顯低于年輕小鼠，雌性的年齡差異更明顯（圖 5a，b）。AP處理的老年雌性的筑巢質(zhì)量和速度相對于年輕雌性沒有差異，并且明顯優(yōu)于V處理的老年雌性，表明女性執(zhí)行功能對系統(tǒng)性衰老細(xì)胞靶向的反應(yīng)顯著改善（圖 5a ）。

接下來，作者實(shí)施了 Spearman 相關(guān)分析，以測試激活的腦免疫細(xì)胞群的豐度是否與認(rèn)知結(jié)果相關(guān)。作者重點(diǎn)分析了用 AP 或 V 治療的老年女性，以專門探索衰老細(xì)胞消除對腦免疫細(xì)胞組成和認(rèn)知變化之間相互作用的影響（圖 5c）。因此，激活的常駐和浸潤性腦免疫細(xì)胞豐度與老年女性的認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)。

圖5 |?B細(xì)胞亞群功能的研究揭示了不同的代謝、生物合成和免疫信號活性

相關(guān)討論

研究揭示了與認(rèn)知變化同步的年齡和性別依賴性的免疫衰老腦細(xì)胞的動態(tài)變化。重要的是，證明了通過轉(zhuǎn)基因方法系統(tǒng)性地靶向 p16 陽性衰老細(xì)胞是一種減輕與認(rèn)知衰退相關(guān)的與年齡相關(guān)的腦炎癥重塑的策略。

使用炎癥和衰老基因組的 NanoString 轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)女性和男性在大腦區(qū)域顯示出不同且共享的年齡依賴性表達(dá)特征，海馬模式更加不同。與男性相比，女性中年齡改變的基因總數(shù)更多，這可能反映了衰老反應(yīng)放大、年輕女性基線表達(dá)較低和/或表達(dá)變異性較小的組合。

使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序scRNA-seq，確定了一個與年齡相關(guān)的髓細(xì)胞群，其特征在于衰老SASP、溶酶體應(yīng)激和 MHC 激活的表達(dá)特征。通路分析揭示了細(xì)胞因子、溶酶體和核糖體功能的改變，以及與阿爾茨海默病的預(yù)測聯(lián)系。總而言之，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，衰老的骨髓細(xì)胞在老年大腦中積聚，并且可能是驅(qū)動與年齡相關(guān)的大腦炎癥的化學(xué)引誘因子的重要來源。

使用體外系統(tǒng)，作者證明了 IR 誘導(dǎo)的衰老腦髓細(xì)胞在體內(nèi)概括了衰老腦髓細(xì)胞的特征，包括含有溶酶體應(yīng)激標(biāo)記物以及上調(diào)和分泌SASP 因子。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)脾細(xì)胞從衰老的腦髓細(xì)胞遷移到含有 SASP 的條件培養(yǎng)基，這表明這些細(xì)胞類型可能被衰老的腦髓細(xì)胞 SASP 募集。特定的外周免疫細(xì)胞特性和介導(dǎo)其趨化性的 SASP 分子是重要的未來方向。

通過認(rèn)知行為測試，作者表明，與老年對照組相比，靶向老年女性的衰老細(xì)胞治療提高了與執(zhí)行功能相關(guān)的筑巢和學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的石迷宮導(dǎo)航的表現(xiàn)。最終證明與年齡相關(guān)的炎癥性腦細(xì)胞成分與認(rèn)知功能障礙有關(guān)，并且可以通過衰老細(xì)胞清除來部分恢復(fù)。

總的來說，作者研究揭示了在細(xì)胞、分子和功能水平上理解大腦衰老的新興框視角。以最近的單細(xì)胞進(jìn)展為基礎(chǔ)，并證明老年大腦中的穩(wěn)態(tài)炎癥的特征是常駐衰老細(xì)胞的擴(kuò)張和免疫群體的浸潤。至關(guān)重要的是，表明 p16 陽性衰老骨髓細(xì)胞及其 SASP 可能介導(dǎo)外周免疫細(xì)胞募集以加劇衰老中的腦部炎癥，并且 p16 陽性衰老細(xì)胞的全身消除可能會使腦免疫細(xì)胞組成恢復(fù)到更年輕的狀態(tài)，同時改善認(rèn)知功能。因此，研究結(jié)果暗示靶向衰老細(xì)胞是對抗與年齡相關(guān)的腦部炎癥和保持認(rèn)知功能的策略。

小鹿推薦

研究采用纖維解剖NanoString nCounter技術(shù)，單細(xì)胞測序技術(shù)，免疫熒光和行為學(xué)實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞、分子和功能水平上揭示了大腦衰老的新機(jī)制。并證明老年大腦中的穩(wěn)態(tài)炎癥的特征是常駐衰老細(xì)胞的擴(kuò)張和免疫群體的浸潤。

通過轉(zhuǎn)基因小鼠和靶向策略證明 p16 陽性衰老細(xì)胞的全身消除可能會使腦免疫細(xì)胞組成恢復(fù)到更年輕的狀態(tài)，同時改善認(rèn)知功能。暗示靶向衰老細(xì)胞是對抗與年齡相關(guān)的腦部炎癥和保持認(rèn)知功能的策略。

使用NanoString 技術(shù)進(jìn)行特定區(qū)域的轉(zhuǎn)錄組分析，使用scRNA-seq技術(shù)確定細(xì)胞分類亞群，利用體外系統(tǒng)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證明特定的外周免疫細(xì)胞特性和介導(dǎo)其趨化性的 SASP 分子是重要的未來方向。最后，文章還提供了年輕（6 個月）和老年（24 個月）小鼠腦細(xì)胞的單細(xì)胞測序的公共在線資源。以上的新型技術(shù)手段給予科研工作者更多的啟示。

綜上，通過認(rèn)知行為測試，作者表明，與老年對照組相比，靶向老年女性的衰老細(xì)胞治療提高了與執(zhí)行功能相關(guān)的筑巢和學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的石迷宮導(dǎo)航的表現(xiàn)。最終證明與年齡相關(guān)的炎癥性腦細(xì)胞成分與認(rèn)知功能障礙有關(guān)，并且可以通過衰老細(xì)胞清除來部分恢復(fù)。

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