來源??TMR Publishing Group

作者??Traditional Medicine Research 編輯部??

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研究亮點

新開發(fā)的Eastern blotting能對粗提物中的人參皂苷進行染色，而雙 Eastern blotting能提示人參皂苷的類型和糖數(shù)與人參皂苷結(jié)構(gòu)的關(guān)系。免疫親和層析敲除法擴大了一步分離人參皂苷的范圍，包括了敲除提取物，從而使粗提物中半抗原分子的真正藥理活性變得明顯。

研究背景

20世紀80年代，許多單克隆抗體（MAbs) 已經(jīng)在醫(yī)學領(lǐng)域積累，但除了天然產(chǎn)物中的靶向藥物之外，很少有特異性。20世紀90年代，萜類化合物，生物堿，酚類化合物，植物皂苷等天然產(chǎn)物的單克隆抗體的制備有所增加，并作為一種重要的分析技術(shù)應(yīng)用于多種天然產(chǎn)物。針對Gs的單克隆抗體的調(diào)查研究顯示，2000年至2020年期間已經(jīng)建立了Gs-Rb1、Rg1 、Re 和三七皂苷R1和Gg-Rg3的單克隆抗體。此外，有研究在膜上建立了一個新的染色系統(tǒng)，繼Northern、Southern 和 Western blotting之后，命名為Eastern blotting。這種新開發(fā)的方法在人參的定量和定性控制方面發(fā)揮了很好的作用。此外，通過親和柱結(jié)合單克隆抗體對抗原的免疫親和可用于少量G的質(zhì)量控制。在這種情況下，通過洗滌液洗脫的部分顯示了從粗提取物中去除抗原的輪廓，結(jié)果被稱為敲除提取物，其可用于確認真正的活性成分。以上這些方法也將在這篇綜述中進行討論。

方法論

半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的合成

通過碘酸鹽氧化法制備半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物。例如G-Rb1與牛血清蛋白偶聯(lián)G-Rb1-BSA。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜測定半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物中半抗原的數(shù)量

1993年引入了MALDI-tof-MS技術(shù)用來確定半抗原數(shù)量，得到了G-Rb1-BSA偶聯(lián)物的質(zhì)譜。分子峰出現(xiàn)在以80，000為中心的雷達峰，這意味著半抗原數(shù)量為5至20 。在毛喉素和鴉片生物堿的測定中也發(fā)現(xiàn)了相同的證據(jù)，從上述證據(jù)中，MALDI-tof-MS可以確認免疫的可能性。

單克隆抗體的免疫、雜交和純化

通過小鼠腹腔注射半抗原-載體蛋白結(jié)合物產(chǎn)生免疫。使用聚乙二醇方法分離脾細胞并與小鼠骨髓瘤細胞融合。通過有限稀釋法克隆雜交瘤。將克隆的雜交瘤的培養(yǎng)基通過親和柱，最后用含鹽的稀乙酸洗脫吸收的IgG。

單克隆抗體對Gs的交叉反應(yīng)性

交叉反應(yīng)性是抗體價值最重要的因素。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，連接在C-3羥基上的雙葡萄糖基團對于G-Rb1單克隆抗體的特異性反應(yīng)是必需的。換句話說，連接在C-3位的葡萄糖部分可以通過高碘酸鈉的氧化而打開，產(chǎn)生醛基，從而與載體蛋白結(jié)合。同時6位的糖是必需的，且與20位的糖無關(guān)。

人體吸收、生物利用度、藥代動力學和代謝中的Gs

人參皂苷是一種結(jié)構(gòu)復雜的化合物，具有典型的三萜、達瑪烷骨架和糖，導致人參皂苷在體內(nèi)代謝困難。研究表明三七中的主要成分三七皂苷R1和G-Rg1的磷脂復合物較三七皂苷R1和G-Rg1的生物利用度顯著增加。研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚對三七皂苷、G-Rg1和G-Rb1的主要代謝產(chǎn)物為羥基化Gs和脫糖Gs。近年來，在大鼠體內(nèi)施用了具有潛在藥理活性的G-Rc，并通過液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)進行了藥代動力學研究。由于良好的分離性和高靈敏度，上述Gs的生物學研究均采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進行。在G-Rb1的情況下，測量范圍為20到400納克/毫升。G-Rb1在人參粗提物中的特異性和靈敏度達到納米量級。中藥和人參提取物中的G-Rb1濃度可通過抗G-Rb1單克隆抗體進行分析，無需預(yù)處理。

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Gs定量分析的Eastern blotting系統(tǒng)

Eastern blotting的步驟如下。將Gs涂布于薄層色譜板上，并用合適的溶劑進行顯色，然后再用H2SO4噴霧并檢測。另取一個薄層色譜板用聚偏二氟乙烯膜片覆蓋，加熱，用NaIO4溶液處理被吸干的聚偏二氟乙烯膜，NaIO4溶液會后裂解Gs及BSA，然后在聚偏二氟乙烯膜上產(chǎn)生Gs-BSA偶聯(lián)物。例如用抗G-Rb1單克隆抗體和過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG處理綴合物，最后暴露于于4-氯-1-萘酚-H2O2溶液中，如圖2所示。

通過蛋白質(zhì)印跡法對幾種人參進行指紋圖譜分析，可以將植物代謝物可視化，并通過染色顏色將其分為PPD和PPT兩種類型。使用G-Rb1單克隆抗體對幾個Gs進行Eastern blotting分析表明，PPD型Gs染色，如G-Rb1，-Rc和-Rd。另一方面，G-Rg1單克隆抗體的染色模式顯示僅檢測到G-Rg1和-Re。此外，我們成功地檢測到雙Eastern blotting，可以分別染色兩種類型的G。在這種情況下，可以確認紅色表示PPT型，粉紅表示PPD型Gs ，如圖3所示。該系統(tǒng)可用于Gs的代謝研究。與此同時美國國立衛(wèi)生研究院的分析儀可用于檢測染色帶，從而可對代謝物進行定性分析。

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Eastern blotting的另一個應(yīng)用是可以對人參根切片的G-Rb1單克隆抗體染色，在這種情況下，PPD型Gs的分布可以通過Eastern blotting來檢測，結(jié)果是韌皮部含有更高濃度的PPD型Gs，木質(zhì)部低得多，表皮幾乎沒有，如圖4所示。人參細胞和組織中Gs的更多詳細信息通過顯微鏡分析進行研究，如圖5所示。

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人參提取物中G-Rb1的免疫親和層析敲除法的建立

利用人參皂苷單克隆抗體經(jīng)瓊脂糖凝膠活化抗體偶聯(lián)、封閉、洗雜、平衡后裝柱并制備人參皂苷免疫親和層析柱。將人參粗提物通過免疫親和柱并用不含Gs的洗滌液完全洗滌時，G-Rb1在含甲醇的洗脫液的洗脫液中表現(xiàn)為單個斑點。如圖6所示，洗滌部分包含除G-Rb1外的所有人參提取物成分。

結(jié)論

本文主要對Gs具有特異性親和力的單克隆抗體的應(yīng)用進行了綜述。重復性好、特異性高、定量的分析檢測系統(tǒng)，如酶聯(lián)免疫吸附試驗，有助于快速、準確地控制人參的質(zhì)量。Eastern blotting系統(tǒng)命名為繼Northern、Southern 和 Western blotting之后的第四種印跡，是一種更特異和敏感的分析系統(tǒng)，與其他方法相比，該方法不僅可以用于Gs，還可用于具有藥理活性天然產(chǎn)物。此外，利用Eastern blotting法對人參進行組織化學研究，使探索人參皂苷在切片中的分布成為可能。由兩種單克隆抗體促進的雙Eastern blotting系統(tǒng)可以成功分離新的Gs并闡明它們的結(jié)構(gòu)，并進一步定性、定量和判斷人參屬物種。同時通過免疫親和分離Gs是小分子天然產(chǎn)物首次通過該方法進行分離。

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引用格式

Sasaki Y, Shimizu K, Watanabe H, Shoyama Y. Application of monoclonal antibody against ginsenoside in ginseng research: a review.?Tradit Med Res. 2021;6(3):25. doi:10.12032/TMR20210118215

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