前 言?

2021年12月，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院楊倩教授及生命科學(xué)學(xué)院林建副教授，于Cell＆Bioscience(IF:7.133) 在線發(fā)表了IBDV 感染雞法氏囊的單細(xì)胞測(cè)序的研究成果。研究工作內(nèi)容的主要承擔(dān)者為Abid Ullah Shah博士。

該研究從雞傳染性法氏囊病毒的鼻腔感染入手，發(fā)現(xiàn)和鑒定了IBDV通過(guò)鼻腔內(nèi)部區(qū)域（嗅細(xì)胞區(qū)域）感染雞，然后轉(zhuǎn)移到血液中傳播到法氏囊。其次該研究對(duì)2周齡和3周齡及對(duì)照組雞感染IBDV不同時(shí)間點(diǎn)的法氏囊樣本進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq），構(gòu)建了IBDV感染雞法氏囊的單細(xì)胞測(cè)序圖譜，探索了IBDV感染后雞法氏囊中B細(xì)胞庫(kù)和免疫反應(yīng)的分子機(jī)制。最后，發(fā)現(xiàn)法氏囊中的基底細(xì)胞是IBDV感染和復(fù)制的主要靶細(xì)胞。

此外，作者發(fā)現(xiàn)Dicer及其相關(guān)酶Ago2 和Exportin5 的表達(dá)被IBDV 復(fù)制大大阻斷，表明家禽的RNAi可能是家禽防御RNA 病毒的主要工具。該研究一方面全面闡述了IBDV 通過(guò)雞鼻腔傳播至法氏囊的傳播途徑及病毒感染主要靶細(xì)胞；另一方面，研究初步闡明家禽細(xì)胞應(yīng)用RNAi抵抗IBDV的分子機(jī)制，為高效防控家禽RNA病毒奠定理論基礎(chǔ)。

?研究背景?

雞作為重要的食用動(dòng)物和模式生物，非常容易被多種RNA病毒（禽流感病毒，傳支病毒，法氏囊病毒等）感染。這些病毒都可以通過(guò)雞的鼻腔入侵和感染。為了確定家禽RNA病毒的通過(guò)家禽鼻腔入侵的具體位點(diǎn)和細(xì)胞，并初步闡明雞對(duì)RNA病毒易感的分子機(jī)制。本項(xiàng)目選取傳染性法氏囊病病毒（IBDV）來(lái)研究家禽RNA病毒通過(guò)鼻腔感染和傳播分子機(jī)制。項(xiàng)目一方面初步闡明了IBDV是如何從雞的鼻腔轉(zhuǎn)移到雞尾部的法氏囊；另一方面通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)深度解析了雞法氏囊中的細(xì)胞亞群及這些細(xì)胞感染IBDV后的變化。

?基本信息?

文章標(biāo)題：From nasal to basal: single-cell sequencing of the bursa of Fabricius highlights the IBDV infection mechanism in chickens

影響因子：7.133

發(fā)表時(shí)間：2021年12月

研究材料：2周齡和3周齡及對(duì)照組各20只SPF雞感染IBDV不同時(shí)間點(diǎn)的鼻、法氏囊(BF)和血液樣品。

研究方法：高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（10x Genoimics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由歐易生物提供技術(shù)支持）

?研究結(jié)果?

1.鼻內(nèi)接種IBDV感染雞鼻上皮細(xì)胞

作者用 IBDV 毒株 (BC6/85) 感染雞，并在感染后72小時(shí)從不同器官收集樣本。RT-qPCR結(jié)果表明通過(guò)鼻腔接種感染導(dǎo)致法氏囊中的滴度高于口服給藥途徑（圖 1a）。為了進(jìn)一步檢測(cè) IBDV 感染后雞鼻腔中的細(xì)胞趨向性，將雞鼻內(nèi)接種 IBDV 并分為四組，然后選擇具有相同間隔的兩個(gè)CS來(lái)顯示雞鼻腔的詳細(xì)解剖結(jié)構(gòu)（圖1b）。進(jìn)一步的HE染色及IHC染色結(jié)果顯示IBDV感染并穿過(guò)雞鼻腔的內(nèi)部橫截面（CS-II），它可以從那里轉(zhuǎn)移到血液中或通過(guò)腸道途徑運(yùn)輸。然而，IBDV并未嚴(yán)重影響NALT（鼻淋巴細(xì)胞）（圖1c-d）。

圖1 雞鼻腔解剖及IBDV感染細(xì)胞的鑒定

2.?IBDV在雞血和PBMC中的復(fù)制和分布

為了探究病毒從法氏囊中復(fù)制后，進(jìn)入血流的復(fù)制及分布情況，在鼻內(nèi)接種 IBDV 后 1 hpi、6 hpi 和 24 hpi 分析了血液和外周血單核細(xì)胞 (PBMC)。IBDV 信使 RNA（mRNA）在 24 hpi 時(shí)在血液和PBMC 中高度積累（圖 2a）。進(jìn)一步地?zé)晒饧せ罴?xì)胞分選 (FACS) 分析顯示，與未感染的對(duì)照雞群相比，1 hpi 和 6 hpi 時(shí) B 細(xì)胞數(shù)量增加，6 hpi后發(fā)生IgM+ B細(xì)胞丟失（圖2b-d）。

圖2 IBDV 在雞血和 PBMC 上的復(fù)制和分布

3.?IBDV在雞法氏囊中的感染和復(fù)制

由于BF是IBDV感染的主要靶器官，隨后用IBDV在鼻內(nèi)給藥，并在不同時(shí)間點(diǎn)收集法氏囊樣本進(jìn)行分析。IBDV在 36 hpi 后觀察到峰值水平，伴隨著片段 A 和 B的高水平（圖 3a）。進(jìn)一步地，IHC 染色結(jié)果表明 IBDV 片段（片段 A 或 B）在 12 hpi 時(shí)幾乎沒(méi)有表達(dá)，而兩個(gè)片段的表達(dá)在36 hpi時(shí)達(dá)到峰值（圖 3a、b、d）。并且免疫熒光測(cè)定（IFA）結(jié)果顯示在兩周和三周大的小雞中都有一些雙陽(yáng)性（VP2 陽(yáng)性和 Bu1 陽(yáng)性）細(xì)胞，且囊泡間隙中的許多Bu1陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)VP2均呈陰性（圖 3c）。

圖3 IBDV在雞法氏囊上的復(fù)制和分布

4.?通過(guò)宿主和病毒轉(zhuǎn)錄組的scRNA-seq構(gòu)建法氏囊細(xì)胞圖譜

為了探究法氏囊濾泡間隙中B細(xì)胞以外的哪些其他細(xì)胞也可能是IBDV感染的目標(biāo)，作者對(duì)對(duì)照和 IBDV 感染組的整個(gè)法氏囊細(xì)胞的 單細(xì)胞RNA-seq。首先將所有樣品中的法氏囊分為對(duì)照和病毒感染組（圖 4a、b）?？偣搏@得了 42484 個(gè)單轉(zhuǎn)錄組，并根據(jù)細(xì)胞中的差異表達(dá)水平進(jìn)一步分布到九個(gè)不同的簇中（圖 4c、d 和附加文件 10），并且將這些細(xì)胞分為五個(gè)簇：兩個(gè)非免疫細(xì)胞類(lèi)型簇和三個(gè)免疫細(xì)胞類(lèi)型簇（圖 4e-f）。隨后的 FACS 分析證實(shí)了這些群體的存在（圖 4g）。除B細(xì)胞群外，2周齡和3周齡組CD45陽(yáng)性細(xì)胞（造血細(xì)胞/白細(xì)胞）比例均下降，而CD4+T細(xì)胞比例均增加（圖4g-h）。

圖4 通過(guò)單細(xì)胞 RNA 測(cè)序鑒定的 IBDV 感染的綜合法氏囊圖

5.?雞法氏囊B細(xì)胞的注釋

B細(xì)胞是IBDV在法氏囊中靶向的主要細(xì)胞，并構(gòu)成最大的細(xì)胞群。作者首先觀察了 IBDV 對(duì)法氏囊 B 細(xì)胞群的影響。數(shù)據(jù)集中的 B 細(xì)胞根據(jù)不同的表面標(biāo)記表達(dá)被分為五個(gè)不同的簇，其中簇 1、2 和 3 占從對(duì)照組分離的B細(xì)胞總數(shù)的 90% 以上，而從 IBDV 感染組中分離出來(lái)的 B 細(xì)胞大多被分為簇 4 和 5（圖5a、b、c、e）。然后檢查了 IBDV 感染后法氏囊中的 B 細(xì)胞免疫球蛋白 (Ig) 庫(kù)，結(jié)果表明 IgM 在所有 B 細(xì)胞群中均有表達(dá)；相比之下，IgY 和 IgA 在簇4中含量豐富，表明這兩種 Ig 亞型僅由受感染的法氏囊B細(xì)胞群分泌（圖 5d），而IBDV 基因組序列僅在簇 4 和簇 5 中觀察到（圖 5f）。此外，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果與scRNA-seq 結(jié)果相一致（圖 5g）。磁激活細(xì)胞分選 (MACS) 分離的 B 細(xì)胞的 qPCR 評(píng)估顯示在法氏囊中的 IgY+ B細(xì)胞中具有高 IBDV 復(fù)制（圖 5h）。

圖5 法氏囊中 B 細(xì)胞分布和 FACS 驗(yàn)證了 IBDV 感染后法氏囊 B 細(xì)胞亞型的變化

6.?法氏囊上皮細(xì)胞的注釋

根據(jù)基因表達(dá)模式將法氏囊上皮細(xì)胞分為九個(gè)亞群，基于高表達(dá)表面標(biāo)志物的進(jìn)一步鑒定導(dǎo)致該群體組織成五種不同的上皮下細(xì)胞類(lèi)型（離子細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、基底細(xì)胞、AT1 細(xì)胞和 AT2細(xì)胞）（圖 6a-d）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)IBDV基因組序列在法氏囊基底細(xì)胞中有大量積累，而一小部分IBDV基因組序列在法氏囊離子細(xì)胞和杯狀細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)（圖6e-f）。進(jìn)一步的結(jié)果表明，除了 B 細(xì)胞群外，IBDV 在法氏囊上皮的基底細(xì)胞中最為普遍。此外，KRT5 促進(jìn)整個(gè)法氏囊中的病毒復(fù)制和分布（圖6g-h）。

圖6 法氏囊細(xì)胞群中的上皮細(xì)胞分布和上皮細(xì)胞亞型中的IBDV分布

7.?雞對(duì)IBDV感染的干擾素反應(yīng)

作為重要的抗病毒因子和先天免疫的參與者，禽類(lèi)中的 I 型干擾素（IFN-α 和 IFN-β）在對(duì)抗病毒感染方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，且 II 型干擾素 (IFN-γ) 在鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物中充當(dāng)先天免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁。因此，作者在體外和體內(nèi)檢測(cè)了IBDV感染后的 IFN 反應(yīng)。體內(nèi)的單細(xì)胞RNA-seq結(jié)果顯示I型IFN不是雞中IBDV感染的抗病毒防御途徑（圖7a-d）。為了驗(yàn)證禽干擾素具有防御病毒復(fù)制的功能這一假設(shè)，作者進(jìn)一步的結(jié)果表明IBDV可以調(diào)節(jié)和阻斷禽細(xì)胞中的IFN系統(tǒng)（圖7e-i）。

圖7 IBDV感染雞干擾素通路的表達(dá)

8.?Dicer在對(duì)抗 IBDV 感染的抗病毒防御機(jī)制中發(fā)揮重要作用

除了干擾素系統(tǒng)，RNAi 是宿主酶Dicer酶識(shí)別的有效抗病毒機(jī)制，雞同時(shí)具有干擾素和RNAi系統(tǒng)。為了探究Dicer是單獨(dú)激活 RNAi 機(jī)制還是與 Ago和 XPO5協(xié)同以防御 IBDV 感染，或是僅在 microRNA 生物發(fā)生中起作用，作者用IBDV感染DF1細(xì)胞，結(jié)果表明細(xì)胞中的miRNA發(fā)生變化（圖8a-b）。對(duì)雞法氏囊中進(jìn)行的細(xì)胞RNA-seq，發(fā)現(xiàn)整個(gè)細(xì)胞群中 Dicer、Drosha、XPO5 和 Ago1基因中的大部分在B細(xì)胞群中表達(dá)；另外，在對(duì)照組中，除T細(xì)胞群外，dicer及其相關(guān)基因均高度表達(dá)。這些結(jié)果提示Dicer酶可能會(huì)切割I(lǐng)BDV基因組并有助于抗病毒防御機(jī)制（圖8c-e）。

圖8 IBDV感染雞Dicer/Ago/Exportin5通路的表達(dá)

?文章總結(jié)?

該研究從雞傳染性法氏囊病毒的鼻腔感染入手，一方面全面闡述了IBDV 通過(guò)雞鼻腔傳播至法氏囊的傳播途徑及病毒感染主要靶細(xì)胞；另一方面，研究初步闡明家禽細(xì)胞應(yīng)用RNAi抵抗IBDV的分子機(jī)制，為高效防控家禽RNA病毒奠定理論基礎(chǔ)。

?圖9 本文的主要結(jié)論示意圖

END

單細(xì)胞? ?撰文

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