沙門氏菌病是指由各種類型沙門氏菌所引起的對人類、家畜以及野生禽獸不同形式的總稱。感染的人或其他動物糞便中的沙門氏菌會污染食品，可使人發(fā)生食物中毒。據(jù)統(tǒng)計在世界各國的細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首，我國內(nèi)陸地區(qū)也以沙門氏菌為首位??。因此對沙門氏菌在宿主內(nèi)生存適應(yīng)機制進行研究，對沙門氏菌感染后治療十分重要。

和其他腸桿菌科細菌相同，沙門氏菌也需要輔因子Fe來參與其固氮、DNA合成和損傷修復(fù)等多個重要生命過程。然而在自然界中的Fe，很難被沙門氏菌直接利用，所以沙門氏菌從宿主細胞中獲得足夠的Fe對其定植及生存至關(guān)重要。但宿主可通過營養(yǎng)免疫來限制其對Fe的吸收，因此沙門氏菌進化出一種具有高鐵親和力的兒茶酚鐵載體——腸菌素（Ent）來對抗宿主的營養(yǎng)免疫?？擅艿氖?，高濃度Fe會產(chǎn)生Fenton反應(yīng)，從而產(chǎn)生大量羥自由基，導(dǎo)致沙門氏菌的死亡。最終在與宿主的相愛相殺過程中，沙門氏菌進化出鐵穩(wěn)態(tài)機制，可使其在獲取所需鐵的同時，又避免過量鐵引起的毒害反應(yīng)。

針對這一鐵穩(wěn)態(tài)機制，山東第一醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所）李冰清團隊在蛋白質(zhì)翻譯后修飾水平對其進行研究，發(fā)現(xiàn)沙門氏菌可通過與Fe代謝有關(guān)的基因——YdiU，直接使高度保守的鐵穩(wěn)態(tài)主要調(diào)節(jié)劑fur?被UMP化修飾（UMPylation），從而消除Fur的Fe吸收抑制能力，最終促進沙門氏菌缺Fe時對Fe的吸收。并且還發(fā)現(xiàn)H118位點是Fur的主要UMP化位點，這對有效調(diào)控沙門氏菌的鐵穩(wěn)態(tài)機制具有重大意義。

研究第一步，作者模擬了其缺Fe環(huán)境，通過qPCR和western blot測定了不同濃度聯(lián)吡啶培養(yǎng)條件下以及600μM聯(lián)吡啶培養(yǎng)不同時間下的沙門氏菌YdiU在mRNA和蛋白水平上的表達量（圖1A-D）。結(jié)果表明YdiU能被聯(lián)吡啶有效誘導(dǎo)表達，說明YdiU可以響應(yīng)金屬缺乏信號。且用聯(lián)吡啶或正常LB培養(yǎng)基同時處理YdiU敲除菌株（ΔydiU）與野生型菌株（WT）時（圖1E-G），通過細菌存活率進一步表明YdiU能被金屬缺乏信號有效誘導(dǎo)，而Fe的回補實驗（圖1H）可以說明YdiU參與Fe的代謝途徑。

有研究表明，為了對抗宿主的營養(yǎng)免疫，腸桿菌科細菌體內(nèi)合成的腸菌素（Ent）被分泌到體外來捕獲鐵原子，隨后結(jié)合了Fe的Ents被一系列鐵腸桿菌吸收蛋白（FepABCDEG）識別并運輸?shù)襟w內(nèi)，以此提升細菌在缺鐵條件下的生存率（圖2D）。因此作者借助基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)，找到了WT和?ΔydiU沙門氏菌在金屬缺乏條件下的251個差異表達蛋白（圖2C）。其中一些Fe吸收相關(guān)蛋白在ΔydiU菌株中被顯著抑制（圖2B）。隨后結(jié)合qPCR（圖2E-F）以及ICP-MS（圖2G）的結(jié)果推測，YdiU是作為一個吸收Fe的激活子，通過上調(diào)Fe吸收相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本，增加參與腸桿菌素生物合成和鐵-腸桿菌素吸收的蛋白質(zhì)水平，來促進沙門氏菌在缺鐵條件下的鐵攝取。

和之前的研究相比，作者在蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中還發(fā)現(xiàn)，在缺Fe條件下，沙門氏菌鐵攝取途徑的主要調(diào)控基因Fur的蛋白水平在WT和?ΔydiU菌株中無明顯差異，同等條件下通過qPCR檢測其mRNA水平，同樣顯示出兩者無明顯差異。由此說明，YdiU對鐵攝取途徑的調(diào)節(jié)必須發(fā)生在Fur轉(zhuǎn)錄后一步。隨后查閱文獻可知，YdiU是一種催化蛋白翻譯后修飾的酶。之前的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明，在表達YdiU的沙門氏菌中存在46個UMP化蛋白，其中包括Fur，且它在H33位發(fā)生UMP化。由于Fur是鐵攝取的主要調(diào)節(jié)器，這表明YdiU通過直接對Fur進行UMP化來發(fā)揮其功能，另外還發(fā)現(xiàn)YdiU是在Fur的H118位點對其進行UMP化。

為進一步研究Fur被UMP化后的功能，作者分析了UMP化的H33和H118位點的空間結(jié)構(gòu)，H33位于Fe結(jié)合位點附近，H118位于Fur同源二聚體的表面。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，UMP化的殘基（H33和H118）在Fur的直系同源物中高度保守，表明YdiU介導(dǎo)的UMP化對Fur的調(diào)節(jié)被廣泛采用。通過建立H118A突變體（由廣州源井生物構(gòu)建），發(fā)現(xiàn)Fur不能被YdiU UMP化，從而證明H118是Fur的主要UMP化位點。為了進一步研究UMP化對Fur特性的影響，作者使用體積排除色譜法分析了YdiU敲除的Fur（FurdYdiU）和YdiU表達的Fur（FurpYdiU），兩者不同的洗脫峰說明YdiU介導(dǎo)UMP化后，F(xiàn)ur的聚集狀態(tài)發(fā)生了改變。隨后用天然凝膠法和動態(tài)光散射法（DLS），對沙門氏菌內(nèi)源Fur與體外UMP化的Fur（FurUMP）進行了比較，與內(nèi)源Fur相比，F(xiàn)urUMP的條帶發(fā)生了偏移。總體結(jié)果表明Fur經(jīng)過UMP化后，穩(wěn)定性更低且更易聚集。隨后又通過凝膠遷移實驗（EMSA）驗證了YdiU通過使Fur UMP化影響Fur的DNA結(jié)合活性。

最終根據(jù)研究結(jié)果，作者提出了以下機械模型（圖3）：當(dāng)沙門氏菌在富鐵環(huán)境中生長時，F(xiàn)ur蛋白與鐵攝取基因的啟動子區(qū)結(jié)合，抑制RNA聚合酶的招募并減少鐵的吸收；當(dāng)沙門氏菌進入宿主細胞時，缺鐵、高活性氧和低pH均會激活YdiU蛋白的表達；然后YdiU通過UTP將一個UMP基團轉(zhuǎn)移到Fur的H118位點，防止Fur的二聚化；Fur從鐵攝取基因的啟動子區(qū)被取代；通過這種機制，沙門氏菌獲得足夠的鐵在宿主細胞內(nèi)生存。鑒定的修飾位點在同源蛋白中高度保守，表明Fur的這種調(diào)控機制普遍存在。UMP到組氨酸的共價連接模式與磷酸化組氨酸（pHis）的共價連接模式相似，這在原核信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。

源井生物在該研究中利用了獨家CRISPR-B?技術(shù)構(gòu)建了沙門氏菌的H118A突變體，有效驗證了鐵穩(wěn)態(tài)主要調(diào)節(jié)劑fur的主要UMP化位點。CRISPR-B?技術(shù)是源井基于Red/ET重組系統(tǒng)和CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，通過優(yōu)化基因編輯載體和基因編輯流程，在基因編輯效率和準確性均遠高于傳統(tǒng)方法的一項創(chuàng)新性技術(shù)。該技術(shù)可實現(xiàn)大腸桿菌/沙門氏菌/銅綠假單胞菌的無痕基因編輯，且應(yīng)用范圍廣泛，可以實現(xiàn)無痕基因敲除、無痕基因點突變和無痕基因敲入，可復(fù)制鏈接了解定制詳情>>https://www.ubigene.com/service/crispr-b/2715.html