水解探針是 qPCR 標(biāo)記的探針，用于通過互補(bǔ)靶向特定序列。水解探針由引物、熒光報告基因和淬滅劑組成，其中報告基因發(fā)出的熒光表明與目標(biāo)序列對齊。

圖 1. 水解探針的組成部分包括互補(bǔ)寡核苷酸或寡核苷酸序列（可與目標(biāo) DNA/RNA 序列雜交的小核苷酸序列）、熒光報告基因和猝滅劑。

寡核苷酸：用于 PCR 探針的寡核苷酸是與目標(biāo)序列互補(bǔ)的 DNA 序列。

熒光報告基因：熒光報告基因是一種 5'-熒光染料。一旦檢測到目標(biāo)序列并且它與猝滅劑分離，該分子就會發(fā)出熒光。發(fā)出綠色熒光的熒光素 (FAM) 通常用作熒光報告基因。

猝滅劑：猝滅劑是一種從熒光團(tuán)吸收激發(fā)能的分子（消耗報告基因的熒光）。換句話說，淬滅劑附著在引物上，當(dāng)它們非常接近時，它會從那里淬滅熒光團(tuán)發(fā)出的熒光。常用的猝滅劑有 Black Hole Quencher 1 染料和 TAMRA。

水解探針如何工作？

在 qPCR 中，水解探針根據(jù)引物與目標(biāo)序列結(jié)合。

然后，在延伸過程中，DNA 聚合酶啟動聚合并對引物執(zhí)行 5' → 3' 核酸外切酶活性。

DNA 聚合酶從引物和猝滅劑中切下熒光報告基因。

然后，熒光報告基因和猝滅劑分離，游離熒光報告基因發(fā)出熒光。

圖 2. 水解探針與互補(bǔ)序列結(jié)合。 聚合酶（紫色箭頭）將熒光報告基因與探針分開，也將其與猝滅劑分開。 與淬滅劑的分離導(dǎo)致報告熒光。

水解探針的三個組成部分，引物、熒光報告劑和淬滅劑，連接在一起，并且它們的構(gòu)型是精確的。

考慮一個可調(diào)節(jié)的運(yùn)動重量。 兩組杠鈴被金屬桿隔開。

圖 3. 將 PCR 水解探針與啞鈴進(jìn)行比較。 啞鈴條代表探針的寡核苷酸。 兩個鈴鐺代表熒光報告基因和猝滅劑。

使用水解探針，將熒光報告基因和猝滅劑置于寡核苷酸的特定位點(diǎn)； 因此，淬滅劑總是淬滅來自報告基因的熒光，而寡核苷酸充當(dāng)連接兩個分子的橋梁。

這些水解探針具有高特異性等優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)楣押塑账嵬ㄟ^互補(bǔ)雜交與您的目標(biāo)序列結(jié)合，并且能夠進(jìn)行多重反應(yīng)。

您可以在同一反應(yīng)中使用多種引物和熒光報告基因。