一、親和層析的基本理論

親和層析是一種通過分子間的特異性識別和相互作用來分離純化物質(zhì)的層析方法。如酶與底物、抗原和抗體之間專一的相互作用等。將其一作為配基固定在填料上，就可以從初始樣品中吸附相應(yīng)的生物分子，然后通過合適的洗脫將其解離達(dá)到純化的目的。配基能與待純化分子之間的相互作用實現(xiàn)純化的目的主要是靜電相互作用、氫鍵、配位鍵、疏水相互作用和弱共價鍵等綜合作用的結(jié)果。

親和作用體系的特異性可以分為高特異性和群特異性。高特異性是指配體與目標(biāo)分子之間的相互作用呈現(xiàn)一對一關(guān)系，例如，抗原與抗體的結(jié)合、酶與底物的結(jié)合等。群特異性是指配體能和一類分子進行結(jié)合，例如，免疫球蛋白與Protein A或ProtienG的結(jié)合、酶與多種配體金屬離子的結(jié)合等。親和層析具有高選擇性、高分辨率、高結(jié)合載量的優(yōu)點，經(jīng)常可以一步純化達(dá)到＞90%的純度，能夠完成一般方法很難完成的分離。

在親和層析中，影響親和作用的因素主要有：（1）離子強度：親和作用的強度通常隨著離子強度的升高而降低；（2）pH：過酸或過堿的條件通常削弱親和作用；（3）抑制氫鍵形成的物質(zhì)：如脲和鹽酸胍的存在會減弱親和力作用；（4）螯合劑：這些化合物會削弱配位鍵，使親和作用減弱或消失。

親和層析的基本操作一般包括5個步驟，分別是平衡層析柱、上樣、洗雜、樣品洗脫以及層析柱再生。首先，選擇合適的緩沖液平衡層析柱，以保證目標(biāo)分子與配體的結(jié)合效率在最佳范圍內(nèi)。上樣時，目標(biāo)分子多數(shù)結(jié)合在配體上，由于混合樣品中的雜質(zhì)不能與配基有效的結(jié)合而流穿下來。上樣完成后，層析柱上通常含有非特異性吸附的雜質(zhì)分子，需要先將這些雜質(zhì)洗脫。雜質(zhì)取出后，再利用洗脫液將目標(biāo)分子從配體上洗脫下來。目標(biāo)分子洗脫后，需要將親和層析柱再生以達(dá)到循環(huán)使用的目的。樣品的上樣前處理是親和層析前的重要步驟，上樣前，需要過濾或者離心樣品以去除固體顆粒成分，以免堵塞層析柱。接著需要調(diào)節(jié)樣品的pH、鹽濃度和添加劑來提高結(jié)合的效率。當(dāng)樣品的緩沖液不適合親和層析時，可利用脫鹽柱置換緩沖液，去除能影響結(jié)合的物質(zhì)。親和層析的洗脫類型分為非競爭性洗脫（改變緩沖液的組成，如離子強度，改變pH等）和競爭性洗脫（目標(biāo)分子類似物和配體類似物等）。
二、親和層析分類詳解

1.?鎳親和層析

過渡金屬通過與電子供體配基上能與金屬離子相互作用的羧基或氨基的電負(fù)性元素（O,N）形成較穩(wěn)定的金屬螯合物。在鎳柱親和層析中，一個Ni2+有六個配位位點，被含有3,4或5個電子供體基團的螯合物固定在吸附劑上，而剩下未被占據(jù)的位點暴露于溶液中，能與組氨酸，半胱氨酸和色氨酸的側(cè)鏈或組氨酸標(biāo)簽的蛋白特異性結(jié)合。?

金屬離子親和層析中常見的螯合配基有IDA（亞氨基二乙酸）、NTA（次氮基三乙酸）和TED（羧甲基乙二胺）等，分別擁有3,4,5個配位位點與Ni2+結(jié)合，而空余的能與組氨酸標(biāo)簽結(jié)合的位點還剩3,2,1個。所以IDA與His標(biāo)簽蛋白結(jié)合的能力相對最強，特異性較弱，而TED則相反。在實際應(yīng)用中通常選擇載量和特異性適中的NTA類型。

鎳柱的洗脫通常采用競爭性洗脫，先用低濃度（10-50 mM）的咪唑?qū)㈦s蛋白和結(jié)合不牢的蛋白洗掉，再用合適濃度的咪唑(200-500 mM)將目的蛋白洗脫。洗脫的先后順序與蛋白的結(jié)合能力相關(guān)。

鎳柱進行蛋白純化時注意事項：(1)避免緩沖液中有高濃度的電子供體基團，比如：甘氨酸，精氨酸等；(2)各種緩沖液中不能有強螯合劑，如EDTA，EGTA等；(3)各種緩沖液里不能有高濃度的強還原劑，比如DTT，防止二價Ni被還原；(4)?不能含離子型的去垢劑，比如SDS，防止Ni流失；(5)在破碎細(xì)胞的時候建議加入蛋白酶抑制劑，比如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解；(6)緩沖液里可以加入甘油，防止蛋白之間由于疏水相互作用而發(fā)生聚集沉淀，甘油濃度最高可達(dá)50%（v/v）；(7)應(yīng)避免含碳酸氫鈉，檸檬酸等物質(zhì)；(8)緩沖液里NaCl的濃度應(yīng)在100mM到2M之間；(9)可加入變性劑促溶，鹽酸胍（最高可6M）,尿素（最高可8M）；(10)可加入非離子型去垢劑，如Triton，Tween，NP-40等，最高2%，可以減少背景蛋白污染和去除核酸污染。?

2.GST-tag親和層析

? ? ?谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）是生物體內(nèi)的一類重要的代謝酶，參與外源和內(nèi)源有毒物質(zhì)的代謝。GST通過催化還原型的谷胱甘肽（GSH）和有毒物質(zhì)偶聯(lián)反應(yīng)，使有毒化合物的水溶性增加從而更容易排出體外，最終達(dá)到解毒的作用。GST親和層析是利用GST融合蛋白與固定的谷胱甘肽（GSH）通過硫鍵共價結(jié)合，通過GSH競爭洗脫的原理來進行蛋白純化。GST親和層析純化蛋白的條件溫和，可以保證蛋白的活性。

GST柱進行蛋白純化時注意事項：(1)在細(xì)胞裂解時，加入終濃度1-10 mM DTT可以顯著提高GST融合蛋白的結(jié)合效率，在Binding Buffer和Elution Buffer中加入1-10 mM DTT，可以提高蛋白純度，但是會導(dǎo)致其產(chǎn)率降低；(2)超聲太劇烈或時間過長會引起蛋白變性，導(dǎo)致蛋白不能與介質(zhì)結(jié)合；(3)在pH值低于6.5或高于8.0結(jié)合效率會降低，使用前需用pH6.5-8.0的Buffer如PBS進行平衡；(4) Elution Buffer的pH值調(diào)至pH 8-9可以提高洗脫效率而不需要增加glutathione的濃度；(5)增加Elution Buffer的離子強度。加入0.1–0.2 M NaCl能提高洗脫效率；(6)Elution Buffer中加入非離子型變性劑。非特異性的疏水作用可能會阻礙GST融合蛋白從介質(zhì)上增溶和洗脫。加入0.1%Triton X-100 or 2% N-octylglucoside可以顯著增加洗脫效率。

3.?MBP-tag親和層析

麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）有?42.5KD?大小，不含?Cys，作為融合蛋白的標(biāo)簽，通常放在?N?端在大腸桿菌中進行表達(dá)。MBP?能促進融合蛋白的可溶性表達(dá)，尤其對于難表達(dá)的真核細(xì)胞蛋白，膜蛋白病毒蛋白有很好的促溶表達(dá)能力，MBP?融合蛋白的純化在生理條件下進行，使用麥芽糖進行溫和洗脫。保護了MBP?標(biāo)簽蛋白的活性。標(biāo)簽在純化后期需要用酶切去除，常用的內(nèi)切酶是?Factor Xa，麥芽糖酶和腸激酶。

4. Protein A親和層析? ?

?ProteinA是一種分離自金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁蛋白，主要通過Fc片段結(jié)合哺乳動物IgG。天然ProteinA有5個IgG結(jié)合域和許多其它的未知功能域。重組ProteinA包含5個高IgG結(jié)合域，并去除了其它非主要結(jié)合域以降低非特異性結(jié)合。?Protein A親和層析介質(zhì)已經(jīng)廣泛用于從生物流體或細(xì)胞培液中分離純化各種類型的IgG或者IgG片段。實驗已經(jīng)證明，Protein A和IgG的相互作用僅涉及Fc區(qū)域，而不影響Fab片段和抗原的結(jié)合。

ProteinA進行蛋白純化時注意事項：(1)介質(zhì)的選擇A,G or?其他，其結(jié)合能力的選擇；(2)上樣流速盡量小，讓Protein A和抗體有充分的結(jié)合時間；(3)在低pH值洗脫后，快速中和；(4)長時間保存樣品加入0.02-0.05％疊氮鈉；(5)加入10%甘油，可有效防止疏水作用引起的聚集；(6)抗體純度不夠，雜蛋白含量高，易引起蛋白的沉淀。

5. FLAG-tag?親和層析

? FLAG標(biāo)簽是由8個氨基酸（DYKDDDDK）組成的一個短肽，分子量很小，因而不會遮蓋融合蛋白中其他的蛋白表位與結(jié)構(gòu)域，也不會改變?nèi)诤系鞍椎墓δ?、分泌或運輸。該標(biāo)簽具有天然的親水特性，很容易定位于融合蛋白的表面，便于利用抗體檢測；同時含有一個腸激酶切割位點（DDDK），可以利用腸激酶切除標(biāo)簽。FLAG標(biāo)簽有2個特異性的單克隆抗體，分別為M1單抗、M2單抗。FLAG短肽合成成本較高，不適用于大規(guī)模純化，且需要額外步驟除去結(jié)合在層析介質(zhì)上的短肽。?

6. Strep-tag親和層析

用于蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等的表達(dá)與純化中。通過對鏈霉親和素特定氨基酸的定向突變，獲得與Strep-tagⅡ具有更高親和力的親和介質(zhì)Strep-tactin，在Strep-tag融合蛋白的親和純化中表現(xiàn)出良好的純化效果，且蛋白質(zhì)產(chǎn)量較高，所需成本適中。? Strep-tagⅡ系統(tǒng)的純化條件比較寬泛，在普通緩沖液下就可與strep-Tactin層析介質(zhì)結(jié)合，使用2.5mmol/L的脫硫生物素就可將Strep-tagⅡ融合蛋白洗脫下來，螯合劑、去污劑、還原劑及高達(dá)1mol/L的鹽均可加入到緩沖液中。此外，Strep-tagⅡ在純化過程中不依賴金屬離子，十分適合含金屬離子蛋白質(zhì)的純化。?

7.肝素親和層析

肝素是一種含有硫酸酯的酸性多糖。根據(jù)肝素的生理作用，可以與很多活性調(diào)節(jié)小分子結(jié)合（其生理作用就是和很多活性調(diào)節(jié)分子結(jié)合抑制其作用），故其能和很多血漿蛋白、生長因子、限制內(nèi)切酶、凝血酶、凝血因子、脂蛋白和干擾素結(jié)合。同時肝素的聚陰離子特性，使其還具離子交換的作用，可用于純化多種核酸結(jié)合蛋白。

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