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近日，中國科學技術大學合肥微尺度物質科學國家研究中心與生命科學學院、中國科學院深圳先進技術研究院腦認知與腦疾病研究所雙聘教授畢國強和劉北明團隊，與美國加州大學洛杉磯分校周正洪教授合作，通過發(fā)展前沿冷凍電鏡斷層三維成像技術，在神經突觸的分子組織架構與功能研究方面取得突破。相關研究成果以Mesophasic organization of GABAA receptors in hippocampal inhibitory synapses為題發(fā)表在Nature Neuroscience.

神經突觸是大腦中眾多神經元之間信息傳遞和存儲的最基本的結構與功能單元。突觸的異常則可能是導致如抑郁癥和阿爾茨海默病等精神與神經疾病的起源。精確解析突觸的蛋白分子結構和組織架構、及其在神經活動或異常過程中的變化是解密大腦奧妙的一個關鍵環(huán)節(jié)，也是腦科學與腦疾病研究中最基礎的核心研究方向之一。由于缺乏有效的研究手段，神經突觸在很大程度上仍舊是一個“黑盒子”。冷凍電鏡（CryoEM）技術的快速發(fā)展，一方面使得眾多通過分離純化后的蛋白質等生物大分子近原子分辨三維結構得以解析，另一方面，基于最新的冷凍電鏡斷層三維成像技術（CryoET）能夠對保存在近生理狀態(tài)下細胞和組織樣本進行納米分辨率的三維成像，為在神經突觸及其它細胞區(qū)室中原位解析蛋白質分子結構和組織架構帶來了新的契機。

畢國強教授多年來著重于發(fā)展用于突觸、神經網絡及全腦尺度解析的前沿顯微成像技術，自從2007年回國后，核心工作之一即是與周正洪教授和匹茲堡大學章佩君教授合作，發(fā)展CryoET原位三維成像技術，重點應用于突觸結構與功能研究，并在合肥微尺度國家研究中心建設了發(fā)展和應用光學與電子顯微技術的集成影像中心，與張小康、陶長路、劉云濤等學生一起，經過長達十年的艱苦攻關，研發(fā)了新型冷凍光電關聯(lián)顯微成像技術，在國際上開創(chuàng)性地開展了基于冷凍電鏡與關聯(lián)顯微成像技術的神經突觸超微結構與功能研究，首次利用CryoET解析了完整神經突觸的三維結構，并實現(xiàn)了對中樞神經系統(tǒng)中兩類最主要突觸-興奮性與抑制性突觸的精確區(qū)分以及結構特征的定量化分析（Tao, JNeurosci, 2018封面文章；Tao, Front Neuroanat, 2018；Liu, Curr Opin Struct Biol,2019；Sun, Biophysics Reports封面文章等）。

在此基礎上，研究團隊發(fā)展了一種基于過采樣與自動分類的冷凍電鏡斷層三維成像亞區(qū)域圖像處理方法，實現(xiàn)了對細胞斷層三維重構圖像中無標記和無模板依賴的蛋白質自動識別和三維重構分析。基于這一方法，研究團隊實現(xiàn)了對抑制性神經突觸中GABAA受體的自動化辨別并解析了其19?分辨率的原位三維結構。 進一步，通過對GABAA受體在突觸中的空間分布進行分析，發(fā)現(xiàn)了這些受體在抑制性突觸中呈現(xiàn)層級狀的組織分布規(guī)則：GABAA受體之間可以形成具有距離固定（11nm間距）而相對角度可變的雙分子復合物；這種雙分子復合物進一步組成具有較低熵并且具備自組織特性的二維網絡；最后形成具有清晰邊界并介于固、液之間的“介態(tài)”相分離狀態(tài)（mesophasic organization）。這種組織形式可以通過突觸后支架蛋白和受體之間靈活相互作用而形成，并且與突觸前囊泡釋放位點存在對應關系。

圖1.冷凍電鏡斷層原位成像技術解析神經突觸受體蛋白原位結構與組織分布

抑制性突觸中受體分子與支架蛋白的這種介態(tài)狀自組織形式，使得突觸同時具備了穩(wěn)定性和可變性，這一特性從分子組織結構層面很好地解釋了學習與記憶的突觸機理。本研究中，對GABAA受體原位三維結構的首次解析，為受體分子等蛋白質的原位高分辨解析以及相應藥物作用機理和治療藥物開發(fā)研究奠定了基礎，審稿人稱贊到：“這是向原位解析生理條件下受體蛋白高分辨結構邁出了至關重要的一步”(an important step forward toward a larger goal of higher resolution structures of native receptors in situ.）。對抑制性突觸分子組織架構的解析表明利用冷凍電鏡技術對突觸超微結構與功能這一“黑匣子”的解密邁出了關鍵的一步，審稿人則評論道：“據我所知，這是首次利用冷凍電鏡斷層成像技術對受體蛋白進行定位研究分析，這一工作將成為領域內的一個里程碑?！保═o my knowledge, this is the first attempt to localize GABA receptors at the ultrastructural level using this approach, and will be one of the landmark paper in the field.）

圖2.抑制性突觸中受體等蛋白分子與細胞器組織分布的三維可視化

(圖片版權：陶長路、劉云濤、畢國強；圖片制作：王國燕、馬燕兵)

本論文共同第一作者為合肥微尺度國家研究中心博士生劉云濤（現(xiàn)美國加州大學洛杉磯分校博士后）和博士后陶長路（現(xiàn)中科院深圳先進技術研究院副研究員），以及中科院深圳先進技術研究院正高級工程師張小康，通訊作者為劉北明教授、周正洪教授和畢國強教授。江蘇大學夏文君副教授完成了其中數(shù)學建模和計算模擬工作。該項目得到國家自然科學基金、中科院B類先導專項、國家重點研發(fā)計劃、中國博士后基金以及安徽省自然科學基金等的資助。陶長路博士獲合肥微尺度國家研究中心優(yōu)秀博士后資助。

文章鏈接為：https://www.nature.com/articles/s41593-020-00729-w

（合肥微尺度物質科學國家研究中心、生命科學學院、科研部）