一、雙縮脲法實(shí)驗(yàn)原理

雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)中，雙縮脲是在大約180°C條件下加熱兩個(gè)尿素分子，以達(dá)到釋放出一個(gè)氨分子而獲得的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，縮二脲和硫酸銅形成紫色絡(luò)合物，稱為縮二脲反應(yīng)。任何包含兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵或可以通過中間碳原子連接的肽鍵的化合物都將發(fā)生縮二脲反應(yīng)。
紫色復(fù)合色的強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比，與蛋白質(zhì)分子量和氨基酸組成無關(guān)。它可以用來確定蛋白質(zhì)含量。測(cè)量范圍是1-10 mg蛋白質(zhì)。干擾測(cè)定的主要物質(zhì)是：硫酸銨，Tris緩沖液和某些氨基酸。
這種方法的優(yōu)點(diǎn)是速度快，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生相似的顏色，干擾物質(zhì)少。主要缺點(diǎn)是靈敏度差。因此，縮二脲法通常不用于蛋白質(zhì)的精確測(cè)定。

二，雙縮脲法所需材料
1種試劑：
標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的制備：用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)晶牛血清白蛋白（bsa）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白制備10mg / ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液?？梢杂?.66 a280校準(zhǔn)純度，bsa濃度為1mg / ml。如有必要，可以使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)預(yù)先通過微凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)氮含量，計(jì)算其純度，然后稱重，并根據(jù)其純度制備標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。用H2O或0.9％NaCl制備牛血清白蛋白，用0.05 NaOH制備酪蛋白。
雙縮脲試劑制備：稱取1.50g硫酸銅（CuSO4?5H2O），6.0g酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6?4H2O），溶于500ml水，在攪拌下加入300ml 10％NaOH溶液，用水稀釋至1升，儲(chǔ)存在塑料瓶（或內(nèi)壁涂有石蠟的瓶子）。該試劑可以長(zhǎng)期保存。如果在儲(chǔ)存瓶中出現(xiàn)黑色沉淀物，則需要對(duì)其進(jìn)行重新配制。
2臺(tái)設(shè)備：
可見光分光光度計(jì)，15個(gè)大試管，渦旋混合器等

三，雙縮脲法的實(shí)驗(yàn)步驟
1標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定：將12個(gè)試管分為兩組，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水補(bǔ)足1ml，再加入4ml縮二脲試劑。搖勻后，在室溫（20-25℃）下放置30分鐘，并在540nm下測(cè)量顏色。第一個(gè)不含蛋白質(zhì)溶液的試管是空白對(duì)照溶液。取兩組測(cè)量值的平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)。
2樣品測(cè)定：取2到3個(gè)試管，并使用相同的方法確定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不應(yīng)超過10mg / ml。