炎癥性腸炎（IBD）發(fā)生期間激活的髓過氧化物酶(MPO)-鹵化途徑會導(dǎo)致宿主組織損傷并加劇炎癥，而環(huán)狀氮氧化物作為MPO抑制劑，具有抗炎和抗氧化活性，然而其在調(diào)節(jié)與IBD相關(guān)的炎癥和損傷的功能與效應(yīng)機制尚未得到專門研究。

本篇由悉尼大學(xué)查爾斯·帕金斯中心的Paul K.Witting教授/課題組在Redox Biology期刊發(fā)表的題為 “The nitroxide 4-methoxy-tempo inhibits the pathogenesis of dextran sodium sulfate-stimulated experimental colitis”（IF：10.787）的研究成果，以小鼠（結(jié)腸組織）為研究對象，通過空間代謝組學(xué)質(zhì)譜成像等研究技術(shù)，全面探究環(huán)硝基氧化物MetT對DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的改善作用，并發(fā)現(xiàn)其通過抑制氧化損傷，減少單核細胞募集和衰減MPO活性等機制發(fā)揮作用，為后續(xù)輔助療法開發(fā)和應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

研究背景

炎癥性腸炎（IBD）作為一種累及回腸、直腸、結(jié)腸的慢性腸道炎癥性疾病?，F(xiàn)有研究顯示，IBD患者的髓過氧化物酶（MPO）水平顯著升高并與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。MPO主要表達在腸道粘膜的浸潤的中性粒細胞之中，能夠消耗過氧化氫（H2O2）進而氧化氯離子（Cl-）產(chǎn)生次氯酸（HOCl）。次氯酸作為一種強大的雙電子氧化劑，能夠破壞組織并在細胞招募中發(fā)揮作用，從而促進IBD的氧化應(yīng)急和炎癥損傷。因此，靶向MPO/ H2O2/鹵化物介導(dǎo)的氧化損傷途徑可能作為調(diào)節(jié)和治療IBD炎癥的有效策略。

環(huán)狀氮氧化物是一類具有抗氧化活性的自由基，表現(xiàn)出超氧化物歧化酶和過氧化氫酶樣活性，從而清除細胞中的反應(yīng)性氧化劑。此外，環(huán)狀氮氧化物作為MPO的底物，也是MPO/ H2O2/鹵化物途徑的有效抑制劑，能夠抑制病理性活性氧（ROS）的積累。前期研究表明，環(huán)狀硝基氧化物在動物模型中顯示出與預(yù)防胃腸道損傷相關(guān)的抗炎和抗氧化活性，并在生物體內(nèi)也具有良好的耐受性，然而其在調(diào)節(jié)與IBD相關(guān)的炎癥和MPO/ H2O2/鹵化物誘導(dǎo)的損傷的潛力尚未得到專門研究。在本研究中，研究人員對一種環(huán)狀硝基氧化物4-甲氧基-TEMPO（MetT）在實驗性IBD模型上的抗氧化和抗炎潛力和效應(yīng)機制進行深入分析。

研究思路

研究方法

1. 實驗分組

（1）研究材料

野生C57BL/6小鼠（每組 n =6，雌性，8~9周）

• 正常對照組（V）：10% v/v DMSO+90% v/v磷酸鹽緩沖鹽水

• MetT對照組（MetT）：正常對照組通過靜脈注射15 mg/kg MetT

• DSS處理組：3% w/v葡聚糖硫酸鈉（DSS）處理9天

• DSS+MetT組：DSS組通過靜脈注射15 mg/kg MetT

（2）生理指標(biāo)

• 小鼠體重

• 臨床評分：基于活動性降低、糞便稠度和直腸出血

• 細胞浸潤水平：InForm軟件

  
  

2.?生化分析

• 魯米諾氧化水平測定：MPO、HRP 或 Mb組

• 生化檢測：結(jié)腸組織裂解液

• 促炎因子的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）：IL-6，IL-10

• 氧化損傷指標(biāo)：谷胱甘肽磺酰胺，3-氯酪氨酸，血清脂質(zhì)過氧化氫（LOOH）

  
  

3. 組織染色

• 多色免疫組化：F4/80，Ly6C，MPO

• 免疫組化：粘蛋白，3-硝基酪氨酸

• TUNEL細胞的免疫熒光染色

4. 檢測技術(shù)

• 質(zhì)譜成像：空間代謝組學(xué)

• 氧化魯米諾的體內(nèi)成像：IVIS? SpectrumCT體內(nèi)成像系統(tǒng)

研究結(jié)果

1. MetT改善接受DSS處理的小鼠臨床參數(shù) | 藥物療效

在小鼠體重變化方面，在DSS損傷的第9天，MetT和載體對照中兩組之間沒有顯著的體重變化，而單獨用DSS處理的小鼠體重相對于載體對照組小鼠平均減少14%。在同一時間點，DSS+MetT組相比DSS組的小鼠顯示出體重減輕程度有所顯著減少（8%，p<0.05）。

在結(jié)腸炎特征得分方面。載體對照組和MetT組中的小鼠在第9天沒有可測量的臨床評分（圖1b）。DSS組小鼠在第9天的臨床評分增加（p<0.05）。相比之下，與DSS+MetT組小鼠顯示出改善的臨床評分（降低?45%；p<0.05）。在隱窩含量方面，與載體對照組相比，用DSS治療9天的小鼠顯示出隱窩數(shù)量（~422）的顯著減少。然而，與從載體對照DSS處理的小鼠獲得的腸道樣本相比，DSS+MetT組中小鼠顯示出顯著更高的隱窩含量（圖1c）。

在杯狀細胞數(shù)量方面，與對照組相比，粘蛋白的免疫組化染色結(jié)果顯示其DSS組小鼠結(jié)腸中顯著減少，而DSS刺激的粘蛋白減少在DSS+MetT組小鼠中明顯有所緩解（圖1d）。另外與對照組小鼠相比，DSS處理組沿橫結(jié)腸和降結(jié)腸長度的粘蛋白水平顯著降低（下降了約11倍）。相比之下，在DSS+MetT組小鼠中，粘蛋白染色僅減少了約2倍，表明MetT在實驗性結(jié)腸炎過程中保留了隱窩和結(jié)腸上皮的完整性（圖1e）。

圖1 | MetT可減輕DSS處理小鼠的體重減輕以及臨床和組織病理學(xué)參數(shù)

2. MetT被機體吸收并定位在結(jié)腸中 | 藥物分布

采用質(zhì)譜成像空間代謝組學(xué)技術(shù)對來自DSS和DSS+MetT處理的小鼠的新鮮冷凍結(jié)腸進行藥物空間分布分析（圖2）。結(jié)果顯示MetT親本離子（186 Da，正電荷）定位于接受DSS+MetT的小鼠的結(jié)腸組織區(qū)域中，而在單獨接受DSS處理的小鼠中基本不存在，表明MetT在小鼠的結(jié)腸組織區(qū)域中積累。

圖2 | 空間代謝組學(xué)檢測MetT在DSS處理小鼠結(jié)腸中的空間分布

3. MetT改善DSS誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)氧化修飾 | 抗氧化活性

體外實驗表明，與沒有NaCl相比（?1400輻射度），MPO+NaCl組中顯著增加了HOCl的底物—魯米諾的氧化水平，其發(fā)光信號約?3800輻射度（圖3a），并強于辣根過氧化物酶（HRP，低活性）以及肌紅蛋白（Mb，無活性）的信號水平。而在NaCl存在下，滴定硝基氧化物MetT能夠抑制MPO酶活性從而降低了魯米諾氧化水平，并呈現(xiàn)對MetT的劑量依賴性抑制（圖3b，c）。

圖3 | MetT抑制MPO / HOCl介導(dǎo)的魯米諾的氧化水平

在谷胱甘肽磺胺（GSA）水平方面。與對照組相比，DSS處理組小鼠的GSA水平顯著增加，然而DSS+MetT組中的GSA水平與單獨使用DSS相比沒有顯著變化（圖4a）。而與對照組相比，3-氯酪氨酸（3-Cl-Tyr）在DSS處理的小鼠中顯著增加，并且在DSS+MetT小鼠中顯著降低至基線水平以下（圖4b，d和e）。表明硝基氧化物MetT能夠緩解結(jié)腸中MPO /HOCl特異性蛋白質(zhì)損傷，但不能抑制GSA的氧化修飾。在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中，循環(huán)脂質(zhì)過氧化氫（LOOH）水平與對照組相比顯著增加了約1.5倍，而在DSS+MetT做中恢復(fù)至基線水平，表明MetT在DSS處理組小鼠中被全身吸收并增強整體的抗氧化狀態(tài)（圖4c）。

圖4 | MetT降低結(jié)腸組織中MPO介導(dǎo)氧化損傷的生物標(biāo)志物水平

研究進一步驗證MetT在體內(nèi)減弱HOCl介導(dǎo)的氧化修飾，研究分析不同組別中的魯米諾氧化的生物發(fā)光水平。其中，載體對照組小鼠的腹部生物發(fā)光很低（總輻射值為?5），而DSS處理組小鼠發(fā)光水平為?30。與單獨使用DSS相比，DSS+MetT組小鼠中的腹部生物發(fā)光信號降低（p = 0.053; 圖 5a 和 b）。該結(jié)果表明MetT能夠抑制MPO介導(dǎo)的氧化活性從而降低MPO/HOCl介導(dǎo)的魯米諾氧化水平。

圖5 | 在對照組，DSS處理組和DSS+MetT組的小鼠中魯米諾氧化的體內(nèi)生物發(fā)光成像

4. MetT改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的免疫細胞浸潤 | 免疫浸潤抑制

與載體組或單獨用MetT處理的小鼠相比，DSS處理組和DSS+MetT組小鼠的總細胞浸潤水平顯著增加，然而MetT給藥顯著降低DSS介導(dǎo)的細胞浸潤程度（圖6a）。總體而言，在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎過程中，免疫細胞MPO+信號強度顯著增加，并且在MetT給藥后減弱至接近基線水平（圖6b）。而相關(guān)性分析表明隱窩完整性與MPO水平呈負(fù)相關(guān)（p = 0.011，圖6c），表明MPO對隱窩有不利影響，并且MetT對于隱窩完整性的維持可能是通過其對MPO的抑制作用來介導(dǎo)的，從而改善小鼠DSS誘導(dǎo)的免疫細胞趨化性。

圖6 | MetT處理發(fā)炎結(jié)腸組織中的組織結(jié)構(gòu)和免疫組織化學(xué)分析

為了鑒定發(fā)炎結(jié)腸中浸潤細胞群表型，在結(jié)腸粘膜對Ly6C單核細胞（紅色），Ly6G嗜中性粒細胞（橙色）和F4 / 80巨噬細胞（綠色）進行定量。并與MPO共同標(biāo)記以評估結(jié)腸MPO的主要來源。其中單核細胞顯示出最高水平的MPO共染色（分別為圖7a-d，e-h和i-l）。與沒有DSS處理的小鼠相比，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎導(dǎo)致單核細胞，中性粒細胞和巨噬細胞在募集到發(fā)炎的結(jié)腸組織中（分別為圖7m，n和o）。在DSS+MetT組中顯著減弱了招募到發(fā)炎結(jié)腸的單核細胞數(shù)量，然而，巨噬細胞和中性粒細胞募集的水平保持不變。這些數(shù)據(jù)表明，MetT在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中改善了免疫細胞浸潤，特別是單核細胞的募集，并且該效應(yīng)與MPO降低相關(guān)，并進一步表明MetT在該動物模型中表現(xiàn)出與抗氧化活性協(xié)同作用的抗炎活性。

圖7 | MetT處理發(fā)炎結(jié)腸組織中的單核細胞，嗜中性粒細胞和巨噬細胞與MPO共同標(biāo)記分析

研究進一步分析MetT在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎期間是否改變了結(jié)腸組織的免疫學(xué)特征，在抗炎細胞因子IL-10和促炎細胞因子IL-6的水平水平方面。與對照組相比，DSS組和DSS+MetT組的IL-10顯著下調(diào)（圖8a），而IL-6顯著增加（圖8b），表明MetT并沒有明顯影響結(jié)腸IL-10和IL-6的水平，其調(diào)控作用可能是一種非免疫調(diào)節(jié)途徑，對MetT的保護作用可能歸因于其抗氧化活性。

圖8 | MetT處理發(fā)炎結(jié)腸組織中的細胞因子IL-10和IL-6表達水平定量

5. MetT可消除結(jié)腸炎中DSS介導(dǎo)的細胞死亡 |?細胞死亡改善

為探究急性結(jié)腸炎期間的細胞死亡特征，本文接著通過結(jié)腸組織樣品中的TUNEL方法檢測細胞死亡。發(fā)現(xiàn)對照組中的結(jié)腸TUNEL標(biāo)記（綠色）很少，而DSS處理的小鼠的結(jié)腸中TUNEL標(biāo)記顯著增加。而與DSS處理組的小鼠相比，DSS+MetT組的小鼠顯示出顯著降低的TUNEL標(biāo)記水平，并與對照組相當(dāng)（圖9a和b）。

圖9?|?MetT處理發(fā)炎結(jié)腸組織中TUNEL的免疫熒光圖像和定量

相關(guān)討論

盡管目前缺乏明確IBD的直接病因，但黏膜損傷和上皮損傷先于影響腸道微生物群的炎癥性損傷，導(dǎo)致特征性中性粒細胞浸潤至粘膜下層，隨后通過活化的MPO和生成HOCl從而產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致能夠?qū)α虼迹|(zhì)和DNA進行不可逆氧化，最終導(dǎo)致細胞死亡。本研究中觀察到活體動物中DSS +MetT處理的小鼠中MPO介導(dǎo)的魯米諾氧化顯著減弱，以及MPO產(chǎn)生的HOCl的特定標(biāo)志物—3-Cl-Tyr水平完全消亡，表明MetT能夠直接抑制MPO鹵化活性。本研究中的數(shù)據(jù)也表明，MetT能夠消除在急性結(jié)腸炎模型中氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細胞死亡。與其他環(huán)狀硝基氧化物的研究相比，本文深入探討環(huán)狀氮氧化物是否在體內(nèi)抑制MPO活性的重要問題，進一步突出環(huán)狀硝基氧化物在體內(nèi)的抗氧化作用。

本研究還證明了MetT給藥調(diào)節(jié)免疫細胞在發(fā)炎結(jié)腸中的各個組織學(xué)區(qū)域的募集。其中巨噬細胞分布主要局限于固有層，取代了DSS處理的小鼠的隱窩結(jié)構(gòu)。目前尚不清楚 MetT 是否在結(jié)腸炎期間直接抑制巨噬細胞對固有層的趨化性，或者 MetT 是否保留了隱窩完整性從而限制了巨噬細胞浸潤。雖然之前的體外報告顯示，在硝基氧化物治療期間中性粒細胞募集減少，但在MetT治療的結(jié)腸炎模型中，并沒有觀察到體內(nèi)中性粒細胞募集的調(diào)節(jié)。相反，我們報告在MetT治療期間，發(fā)炎結(jié)腸的單核細胞募集顯著減少。因此，局部MPO鹵化活性的降低也可以歸因于含有MPO的其他白細胞（例如單核細胞）的募集減少。

研究結(jié)論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

與單獨接受DSS的小鼠相比，用4-甲氧基-TEMPO（MetT）治療的小鼠的體重，臨床評分，粘蛋白水平和隱窩健康狀況等指標(biāo)顯著改善。基于結(jié)腸切片的空間代謝組學(xué)質(zhì)譜成像結(jié)果表明MetT在結(jié)腸中積累，并通過抑制結(jié)腸中的MPO / HOCl活性和氧化等生物標(biāo)志物的組合顯著改善實驗性結(jié)腸炎病程。

MetT還通過促進細胞存活來恢復(fù)結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)，通過一種非免疫調(diào)節(jié)途徑，抑制免疫細胞滲透到腸道層的程度?；隰斆字Z的活體動物小鼠成像也顯示，在用MetT預(yù)處理的小鼠中，腹部生物發(fā)光顯著衰減，與MPO抑制一致，從而產(chǎn)生對結(jié)腸的氧化損傷的衰減?？傮w而言，硝基氧化物MetT在小鼠中具有良好的耐受性，并有效抑制了DSS刺激的急性結(jié)腸炎。

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結(jié)腸炎期間的MPO鹵化途徑激活會導(dǎo)致宿主組織損傷并加劇炎癥。而環(huán)狀氮氧化物作為MPO抑制劑，具有強大的抗炎和抗氧化能力。本研究圍繞DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的各類臨床和生化指標(biāo)，同時也采用了空間代謝組學(xué)的技術(shù)，全面探究環(huán)硝基氧化物MetT對結(jié)腸炎的改善作用，并發(fā)現(xiàn)其通過抑制氧化損傷，減少單核細胞募集和衰減MPO活性等機制發(fā)揮作用?？傮w而言，該研究突出了環(huán)狀氮氧化物的治療潛力，為類似研究提供新穎見解。其嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒炈悸泛驮攲嵉难芯拷Y(jié)果，值得廣大讀者進行借鑒和參考。

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