豆科植物成功的關(guān)鍵是能夠形成和保持最佳的根瘤共生的能力，使根瘤菌生長(zhǎng)和植物生長(zhǎng)之間維持動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)系。細(xì)胞分裂素（CK）在結(jié)瘤的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中至關(guān)重要，但其作用機(jī)制仍不完全清楚。

2022年12月，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李霞團(tuán)隊(duì)在Nature Communications上發(fā)表題為“The B-type response regulator GmRR11d mediates systemic inhibition of symbiotic nodulation”的研究論文，發(fā)現(xiàn)B型反應(yīng)調(diào)節(jié)因子GmRR11d通過(guò)誘導(dǎo)大豆根系對(duì)CK的超敏反應(yīng)，以及抑制結(jié)瘤信號(hào)關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄，控制大豆根瘤數(shù)量，調(diào)控大豆共生固氮反應(yīng)。

研究結(jié)果

1.發(fā)現(xiàn)GmRR11d可以通過(guò)與GmNSP1互作參與結(jié)瘤生長(zhǎng)調(diào)控過(guò)程

大豆中，NSP1（結(jié)瘤信號(hào)通路蛋白）可以激活（結(jié)瘤形成起始）基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)根瘤發(fā)生，且受細(xì)胞分裂素介導(dǎo)，其在進(jìn)化上具有保守性。基于此，研究者提出假設(shè)：大豆的結(jié)瘤自調(diào)控系統(tǒng)（AON），是否可以誘導(dǎo)某種轉(zhuǎn)錄因子抑制NSP1的轉(zhuǎn)錄活性，從而對(duì)結(jié)瘤形成負(fù)向調(diào)控，維持根瘤共生的動(dòng)態(tài)平衡呢？為了驗(yàn)證此假設(shè)，研究者首先通過(guò)基因敲除等實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了GmNSP1對(duì)大豆結(jié)瘤形成的正向調(diào)控作用。接著，以GmNSP1a為誘餌通過(guò)酵母雙雜交篩選技術(shù)，在大豆根瘤cDNA文庫(kù)中篩選其互作蛋白。其中一種互作蛋白為B型RR蛋白，在擬南芥中的同源蛋白為ARR11，對(duì)細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的根生長(zhǎng)具有重要調(diào)控作用。通過(guò)基因組搜索和結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)大豆中存在4種ARR11同源基因，研究者分別將其命名為GmRR11a，GmRR11b，GmRR11c，GmRR11d，通過(guò)Y2H、Co-IP等進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)GmNSP1a與GmRR11d確實(shí)存在相互作用（圖1），推測(cè)GmRR11d可以通過(guò)與GmNSP1a互作參與大豆結(jié)瘤生長(zhǎng)調(diào)控過(guò)程。

圖1 | GmRR11d與GmNSP1a存在相互作用

2.GmRR11d正向調(diào)控根對(duì)細(xì)胞分裂素的敏感性

研究者基于GmRR11d在擬南芥中的同源基因的功能，探索GmRR11d是否也介導(dǎo)大豆根生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)細(xì)胞分裂素的響應(yīng)；通過(guò)在毛狀根表達(dá)和兩種載體，分別檢測(cè)大豆根系的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)不同濃度BAP（外源細(xì)胞分裂素）的響應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因大豆根系對(duì)細(xì)胞分裂素敏感性增強(qiáng)，根系生長(zhǎng)受CKs的抑制性表現(xiàn)更敏感，而轉(zhuǎn)基因大豆根系生長(zhǎng)受CKs的抑制性減弱，對(duì)細(xì)胞分裂素敏感性顯著降低（圖2），說(shuō)明GmRR11d是大豆中CK信號(hào)和植物CK響應(yīng)的正調(diào)控因子。

圖2 | GmRR11d響應(yīng)細(xì)胞分裂素，正向調(diào)控大豆根系對(duì)CKs的敏感性

3.GmRR11d被根瘤菌誘導(dǎo)表達(dá)，并在根瘤中具有高表達(dá)量

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在大豆根系中被根瘤菌快速誘導(dǎo)，在根瘤的形成過(guò)程中，表達(dá)量呈現(xiàn)為升-降-升-降的趨勢(shì)；通過(guò)GUS組織染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，由根瘤菌誘導(dǎo)，并在整個(gè)根瘤形成過(guò)程中表達(dá)，且主要集中在根瘤的皮質(zhì)區(qū)（圖3）。

圖3 | 大豆根瘤形成過(guò)程中的表達(dá)模式

4.GmRR11d在大豆結(jié)瘤過(guò)程中起著負(fù)調(diào)控因子的作用

通過(guò)功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步明確GmRR11d在大豆結(jié)瘤過(guò)程中作用，研究者構(gòu)建了和兩種轉(zhuǎn)基因大豆植株，并統(tǒng)計(jì)21DAI時(shí)根瘤數(shù)量，出乎意料的是，根產(chǎn)生的根瘤明顯比對(duì)照根減少約41%，而敲除株，根瘤數(shù)量顯著增加，幾乎增加了一倍（圖4），說(shuō)明GmRR11d是大豆結(jié)瘤的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子。

圖4 | GmRR11d對(duì)大豆根瘤數(shù)量的影響

5.GmRR11d負(fù)調(diào)控根瘤數(shù)量的作用機(jī)制研究

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GmRR11d主要通過(guò)兩種方式對(duì)根瘤形成起負(fù)調(diào)控作用：一種是GmRR11d直接靶向啟動(dòng)子，行使負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子功能，抑制的轉(zhuǎn)錄表達(dá)（圖5）；一種是GmRR11d通過(guò)與GmNSP1a互作，干擾GmNSP1a作為正向轉(zhuǎn)錄因子對(duì)的轉(zhuǎn)錄激活，從而抑制及其下游結(jié)瘤基因的表達(dá)（圖6）。

此外，GmRR11d在大豆的結(jié)瘤自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)(AON)中處于什么位置，扮演什么角色呢？研究者根據(jù)已得結(jié)果：被根瘤菌誘導(dǎo)，在根瘤形成開(kāi)始時(shí)達(dá)到最高表達(dá)水平，但隨著結(jié)瘤形成時(shí)間延長(zhǎng)，負(fù)調(diào)控根瘤數(shù)量，提出假設(shè)可能被AON上調(diào)表達(dá)，從而抑制結(jié)瘤的進(jìn)一步形成。為了驗(yàn)證該假設(shè)，研究者檢測(cè)了野生型大豆、大豆（GmNARK敲除突變體，GmNARK是一種CLV1樣受體激酶，可抑制芽中的結(jié)瘤數(shù)量）中轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)在受感染的根中轉(zhuǎn)錄幾乎被完全阻斷（圖7a,b）。并且在兩種植株中分別過(guò)表達(dá)，觀察結(jié)瘤形成數(shù)量差異，發(fā)現(xiàn)nts1007突變體確實(shí)表現(xiàn)出超結(jié)瘤表型，而過(guò)表達(dá)的根瘤數(shù)量顯著減少，突變體的超結(jié)瘤表型幾乎完全得到恢復(fù)，說(shuō)明GmNARK可能通過(guò)誘導(dǎo)根中的表達(dá)來(lái)抑制結(jié)瘤（圖7efg）。另外，研究者發(fā)現(xiàn)GmRR11d作用機(jī)制與AON系統(tǒng)中已知的負(fù)調(diào)控因子GmTNL1b間不存在上下游調(diào)控關(guān)系。

已有研究表明，在擬南芥中，B型RR基因的轉(zhuǎn)錄水平對(duì)CKs不敏感，但CKs可以通過(guò)增強(qiáng)B型RR蛋白與靶基因的結(jié)合，調(diào)控根的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究中已證明了GmRR11d與擬南芥B型RR基因不同，它是受不同濃度的CKs誘導(dǎo)的，但是CKs是否也能增強(qiáng)GmRR11d與靶基因的結(jié)合呢？通過(guò)ChIP檢測(cè)等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂素促進(jìn)GmRR11d與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而抑制的轉(zhuǎn)錄，參與根瘤形成的調(diào)控（圖7h）。

圖5 | GmRR11d直接靶向的啟動(dòng)子，抑制的表達(dá)

圖6 | GmRR11d與GmNSP1a相互作用并抑制其轉(zhuǎn)錄活性

圖7 | GmRR11d是大豆GmNARK的下游調(diào)控因子

文章總結(jié)

本研究通過(guò)酵母雙雜交篩選到了一種結(jié)瘤調(diào)控相關(guān)蛋白——B型反應(yīng)調(diào)節(jié)因子GmRR11d，并且建立了一種GmRR11d在結(jié)瘤自主調(diào)控系統(tǒng)中的工作模型（圖7i)。即在低氮條件下，根瘤菌侵染大豆，GmRR11d水平較低，CK水平適合結(jié)瘤，GmNSP1s與GmNSP2復(fù)合物激活的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)瘤形成和結(jié)瘤的自動(dòng)調(diào)節(jié)（AON）；感染后期，AON的激活，促使GmNARK誘導(dǎo)表達(dá)，GmRR11d同時(shí)誘導(dǎo)CK超敏反應(yīng)及抑制表達(dá)和NF信號(hào)通路，阻斷根瘤菌感染，抑制根瘤的進(jìn)一步形成。本研究對(duì)理解大豆根瘤共生系統(tǒng)，解析大豆固氮效率調(diào)控機(jī)制，指導(dǎo)高效固氮植物育種具有重要意義。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀博士生陳嘉歡為本文第一作者，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)王志娟副教授、山西農(nóng)業(yè)大學(xué)王利祥教授為共同第一作者，李霞教授為通訊作者。德國(guó)海德堡大學(xué)的Chao Su博士和Thomas Ott教授也參與了該項(xiàng)工作。該研究工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校自主科技創(chuàng)新基金、湖北省自然科學(xué)基金的支持及嶺南實(shí)驗(yàn)室基金支持。

項(xiàng)目中所用的大豆根瘤酵母文庫(kù)由歐易生物構(gòu)建。

Doi：https://doi.org/10.1038/s41467-022-35360-9

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排版人：小久

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