結(jié)直腸癌 (Colorectal Cancer，CRC) 是一種以基因突變累積和免疫反應(yīng)失調(diào)為主要特征的腸上皮異質(zhì)性疾病，是第三大最常見的癌癥，在全球癌癥死亡率中高居第二。據(jù)報道，CRC的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)明顯的年輕化趨勢，尤其在低收入和中等收入國家中居多，這一惡性態(tài)勢給人類健康帶來了嚴(yán)重威脅。因此，研究CRC的發(fā)病機制及治療手段以實現(xiàn)CRC的臨床診斷和治療已經(jīng)成為廣大患者的迫切訴求。

近年來，隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，人類疾病的神秘面紗正被逐步揭開，當(dāng)然，CRC也不在例外。其中，以CRISPR/Cas9（一種以gRNA指導(dǎo)工程核酸酶（Cas9）實現(xiàn)對靶向目的基因位點進(jìn)行快速、輕松及高效的DNA編輯技術(shù)）為核心的基因工程技術(shù)廣受科研人員的青睞，成為挖掘參與CRC調(diào)控的關(guān)鍵基因及開發(fā)潛在治療靶點的關(guān)鍵技術(shù)。本文精選了近期聚焦于基因敲除細(xì)胞、點突變細(xì)胞的CRC研究，旨在為廣大科研用戶開拓更多以基因編輯細(xì)胞為工具研究CRC的思路。

案例一：
基于CRISPR/Cas9全基因組敲除篩查確定GRB7是KRAS突變結(jié)腸癌對MEK抑制劑產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵基因

靶向KRAS通路是一種兼具前景且富挑戰(zhàn)性的結(jié)直腸癌治療方法。盡管MEK抑制劑（MEKi）在BRAF突變的黑色素瘤中顯示出療效，但由于CRC細(xì)胞胞內(nèi)代償信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而產(chǎn)生的藥物耐受限制其在CRC臨床應(yīng)用。因此，迫切需要確定與MEKi抗性相關(guān)的關(guān)鍵基因并提供聯(lián)合治療來克服MEKi耐藥性以拓展MEKi的臨床應(yīng)用。

基于此，研究人員設(shè)計了一種組合策略，包括全基因組?CRISPR/Cas9敲除文庫篩選和?KRAS點突變細(xì)胞系（HCT116）的轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果顯示：幾個基因（EGFR、MET、FAK、STAT3及AKT）被確定為與MEKi抗性相關(guān)的候選基因，它們在GRB7介導(dǎo)的RTK通路中顯著富集。

為了驗證GRB7在MAPKi抗性方面的關(guān)鍵作用，研究人員評估shRNA敲降GRB7后KRAS突變的CRC細(xì)胞在MEKi存在的增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在GRB7敲降后，CRC細(xì)胞系（HCT116、SW480、LS174T）在MEKi存在環(huán)境中增殖能力顯著下降，且細(xì)胞凋亡加速。此外，通過過表達(dá)GRB7研究在CRC模型細(xì)胞系中抗性的獲得情況。發(fā)現(xiàn)GRB7基因過表達(dá)后，CRC細(xì)胞克隆形成能力顯著提升，且細(xì)胞凋亡比例下降。這一系列的結(jié)果表明GRB7調(diào)控KRAS突變的CRC細(xì)胞中MEKi耐藥性。

進(jìn)一步的，研究人員依托免疫共沉淀與質(zhì)譜聯(lián)用（IP-MS）技術(shù)確定PLK1是GRB7的主要相互作用激酶，并在2D和3D的CRC模型中證實了PLK1和MEK抑制劑的組合在體外和體內(nèi)協(xié)同抑制CRC?細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)程。

綜上所述：這項研究將?GRB7-PLK1鑒定為介導(dǎo)RTK的核心軸，導(dǎo)致MEKi藥物耐受。因此，PLK1協(xié)同MEKi是臨床上治療具有KRAS突變CRC患者的潛在靶點。

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案例二：

組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶NSD2是結(jié)直腸癌重要致癌基因

組蛋白3（H3）甲基化可能導(dǎo)致多種癌基因的轉(zhuǎn)錄激活，與CRC疾病的發(fā)展及進(jìn)程密切相關(guān)。核受體SET結(jié)構(gòu)域蛋白2（NSD2）是催化組蛋白H3賴氨酸36二甲基化（H3K36ME2）的關(guān)鍵組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶。研究表明，NSD2在幾種實體腫瘤中過表達(dá)。然而，NSD2在CRC中的表達(dá)情況、潛在功能及分子機制未曾報道。

基于此，科研人員展開此項研究。首先，通過基因表達(dá)譜交互數(shù)據(jù)庫?(GEPIA)的生物信息學(xué)結(jié)果表明，NSD2 mRNA表達(dá)在結(jié)腸癌和直腸癌中升高。此外，局部結(jié)腸癌組織中的NSD2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著高于周圍正常組織中的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

在采用shRNA誘導(dǎo)的沉默或CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的NSD2敲除原發(fā)性人結(jié)腸癌細(xì)胞和NSD2敲除CRC細(xì)胞系中，細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程、遷移及侵襲能力明顯得到抑制。

反之，通過慢病毒構(gòu)建NSD2過表達(dá)的原發(fā)性人結(jié)腸癌細(xì)胞株（pri-Can-1），細(xì)胞在增殖、侵襲及遷移能力明顯上升。

研究人員在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)，NSD2敲除或沉默的原發(fā)性人結(jié)腸癌細(xì)胞中H3K36me2的水平和NSD2相關(guān)致癌基因ADAM9、EGFR、Sox2、Bcl-2、SYK和MET的表達(dá)在很大程度上受到抑制。然而，它們的水平隨著NSD2過度表達(dá)而增加。

最后，體內(nèi)腹腔注射AAV包裝的NSD2 shRNA可在很大程度上抑制了裸鼠中的原發(fā)性結(jié)腸癌細(xì)胞的生長，且定量分析發(fā)現(xiàn)H3K36me2的水平和致癌基因的表達(dá)明顯下降。

綜上所述，NSD2是CRC體外和體內(nèi)生長所需的一種新的重要致癌基因，靶向NSD2可能是CRC治療的潛在策略。

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