上周上傳了Co-IP（免疫共沉淀實驗）技術(shù)視頻的課件，反響還不錯，有同學留言想看RIP實驗流程，今天這篇文章就展開講講RIP實驗流程！

在這篇文章中，你可以查找進行RIP實驗所需要的一切，包括一份正確試劑的列表以及實驗方案每個步驟的疑難解答提示。

RIP技術(shù)定義

RIP是一種基于抗體的技術(shù)，用于定位體內(nèi)的 RNA-蛋白質(zhì)相互作用。將所關(guān)注的 RNA 結(jié)合蛋白 (RBP) 與其結(jié)合的 RNA 一起進行免疫沉淀，然后鑒定結(jié)合的 RNA（mRNA、非編碼 RNA 或病毒 RNA）。結(jié)合的 RNA 可以通過實時 PCR、微陣列或測序的方法進行檢測。

最近，表觀遺傳學和 RNA 生物學領(lǐng)域?qū)Σ煌?RNA 作用和功能的關(guān)注大大增加。據(jù)觀察，RNA 的功能遠不止轉(zhuǎn)錄和后續(xù)的翻譯。例如，RNA-蛋白質(zhì)相互作用能夠調(diào)控 mRNA 和非編碼 RNA 的功能。對 RNA 潛能的這一新認識帶動了新方法的發(fā)展，使研究人員能夠定位 RNA-蛋白質(zhì)相互作用。RIP 是一種研究單個蛋白質(zhì)和 RNA 分子間物理結(jié)合的實驗方案。

RIP實驗基本原理

1、用抗體或表位標記物捕獲細胞核內(nèi)或細胞質(zhì)中內(nèi)源性的 RNA 結(jié)合蛋白。

2、防止非特異性的 RNA 的結(jié)合。

3、免疫沉淀把 RNA 結(jié)合蛋白及其結(jié)合的 RNA 一起分離出來。

4、結(jié)合的?RNA 序列通過 microarray(RIP-Chip)，定量 RT-PCR 或高通量測序(RIP-Seq)?方法來鑒定。

RIP實驗基本步驟

一、細胞裂解液獲取

A.??單層細胞或者貼壁細胞處理

1、冷 PBS 清洗培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的細胞兩次；

2、加入冷?PBS 后用細胞刮將細胞刮下來，收集至 enpendoff 管；

3 、1500 rpm ，4℃離心 5 min，棄上清，收集細胞；

4、用與細胞等體積的 RIP?裂解液重懸細胞，吹打均勻后于冰上靜置 5 min；

5、每管分裝 200 μl 細胞裂解液，貯存于-80℃。

B.??懸浮細胞處理

先收集細胞再計數(shù)，然后清洗裂解。

C.??組織樣品處理

1、冷 PBS 清洗新鮮切下的組織三次；

2、加入冷 PBS?后，用勻漿器或其他細胞分離設備使組織分散為單個細胞，計數(shù)；

3 、1500 rpm ，4℃離心 5 min，棄上清，收集細胞；

4、用與細胞等體積的 RIP?裂解液重懸細胞，吹打均勻后置于冰上靜置 5 min；

5、每管分裝 200 μl 細胞裂解液，貯存于-80℃。

二.??磁珠的準備

A.??實驗前準備

1 、enpendoff 管

2、磁力架

3、冰盒， ?RIP Wash Buffer 置于冰上

4、抗體，置于冰上

5、渦旋震蕩器

6、槍、槍頭放于超凈臺照射 30min，槍噴 DEPC?水

B.??磁珠準備過程

1、重懸磁珠

2、標記實驗所需的 enpendoff?管，樣品包括目的樣品，陰性對照與陽性對照；

3、吸取 50 μl??重懸后的磁珠懸液于每個 enpendoff 管；

4、每管加入 500 μl RIP Wash Buffer，渦旋震蕩；

5、將 enpendoff?管置于磁力架上，并左右轉(zhuǎn)動 15°使磁珠吸附成一條直線，去上清，?重復一次；

6、用 100?μl 的 RIP Wash Buffer 重懸磁珠，加入約 5 μg 相應抗體于每個樣品中；

7、室溫孵育 30 min；

8、將 enpendoff 管置于磁力架上，棄上清；

9、加入?500 μl RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后棄上清，重復一次；

10、加入 500 μl RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后置于冰上。

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三.?RNA?結(jié)合蛋白免疫沉淀

A.??準備工作

1、冰盒

2?、360°旋轉(zhuǎn)儀

3 、RIP?Wash?Buffer??、0.5M EDTA ?、RNase Inhibitor ?置于冰上

B.?RNA?結(jié)合蛋白免疫沉淀實驗過程

1、準備 RIP?Immunoprecipitation?Buffer；

2、將前上步的 enpendoff 管放磁力架上，去上清，每管加入 900 μl RIP Immunoprecipitation?Buffer；

3、迅速解凍第一步制備的細胞裂解液， 14,000 rpm ，4℃離心 10 min。吸取 100 μl 上清?液于上一步的磁珠-抗體復合物中，使得總體積為 1 ml；

4 、4℃孵育 3 h?至過夜；

5、短暫離心，將 enpendoff 管放在磁力架上，棄上清；

6、加入 500 μl RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后將 enpendoff 管放在磁力架上， 棄上清， 重?復清洗 6 次；

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四、?RNA?純化

A.??實驗前準備

1 、槍、槍頭、enpendoff 管紫外照射 30min，噴 DEPC 水以除 RNA 酶；

2、Salt Solution Ⅰ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS 、 Precipitate?Enhancer??置于冰上；

3?、RNase-free 的乙醇、氯仿、異戊醇；

4 、4.DEPC?水置于冰上；

5?、5. ?離心機預冷；

6?、6. ?冰盒。

B.?RNA?純化過程

1、準備 Proteinase?K?Buffer。每個樣品需 150 μl；

2、用 150?μl Proteinase K Buffer 重懸上述磁珠-抗體復合物；

3?、55℃孵育 30 min；

4、孵育完之后，將 enpendoff?管置于磁力架上，將上清液吸入一新的enpendoff?管中；

5、于每管上清液中加入 250 μl RIP Wash Buffer；

6、于每管加入 400 μl 苯酚：氯仿： 異戊醇， 渦旋震蕩 15 s ，室溫下 14,000 rpm 離心 10?min；

7、小心的吸取 350 μl 上層水相，吸入另一新的enpendoff?管；

8、于每管加入 400 μl 氯仿，渦旋震蕩 15 s ，室溫下 14,000 rpm 離心 10 min；

9、小心的吸取 300 μl 上層水相，吸入另一新的enpendoff?管；

10、每管加入 50 μl?Salt?Solution?Ⅰ，15 μl Salt SolutionⅡ, 5 μl Precipitate Enhancer ?，850?μl??無水乙醇(無 RNase)，混合， -80℃保持 1 h 至過夜；

11 、14,000 rpm ，4℃離心 30 min，小心去上清；

12、用?80%乙醇沖洗一次， 14,000 rpm ，4℃離心 15 min，小心去上清，空氣中晾干；

13 、10-20 μl DEPC 水溶解， -80℃保存，送測序。

掃碼+回復關(guān)鍵詞RIP905

領(lǐng)取RIP實驗7大常見問題

你將獲得RIP實驗7大常見問題

1?、RIP?試驗需要注意什么?

2、為什么抗體無法沉淀?RIP?裂解液中的目標蛋白?

3、提取?RNA?時，蛋白酶?k?消化不完全是什么原因?

4、提取?RNA?后，?A260/A280?比值偏離?1.8~2.2?區(qū)域是什么原因?

5、做?RIP?的時候和?beads?孵育的lysate?的濃度如何確定???有些動物的文獻提到用細胞?板數(shù)細胞個數(shù)，想知道如果用蛋白濃度的話，大概在什么數(shù)量范圍的蛋白總量對應?50??ulBEADS?

6、RIP?可以分提核漿的?RNA-蛋白質(zhì)復合物嗎?

7、因為?RIP?做完得到的是?RNA?序列，要做后續(xù)檢測，比如測序、判斷目標序列位置

等，是不是都必須要做?RT-PCR，得到逆轉(zhuǎn)錄的?DNA?后，后面就跟?ChIP?相同了？