細(xì)胞死亡的相關(guān)研究一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。依據(jù)發(fā)生機(jī)制的不同 （起始的刺激、中間過程的激活和末端的效應(yīng)器的不同） ，細(xì)胞的死亡可以區(qū)分為不同的方式，常見的有細(xì)胞凋亡、焦亡、壞死、鐵死亡等。

　　圖 1. 不同死亡方式的比較

　　"鐵死亡"的相關(guān)研究更是近幾年熱點(diǎn)中的“熱點(diǎn)“，這也證明了金屬元素在細(xì)胞死亡中的獨(dú)特作用。迎來鐵死亡，又遇銅死亡。

　　今年 3 月題為 Copper induced cell death by targeting lipoylated TCA cycle protein 一文提出：生物體內(nèi)不可缺少的微量元素—銅在其濃度超過了維持穩(wěn)態(tài)機(jī)制的閾值時也會表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。這種現(xiàn)象與鐵積累導(dǎo)致細(xì)胞死亡的情況有相似之處 （但機(jī)制明顯區(qū)別于鐵死亡）。研究人員將這種銅離子誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制命名為 “銅死亡” （Cuproptosis）。

　　■ 銅死亡的簡要機(jī)制

　　銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡： 當(dāng) Cu2+ 在依賴線粒體呼吸的細(xì)胞中過度積累 （Cu2+ 通過銅離子載體運(yùn)入細(xì)胞），Cu2+ 與硫辛?；?DLAT 結(jié)合，誘導(dǎo) DLAT 的異聚化。不溶性 DLAT 的增加導(dǎo)致細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

　　注：蛋白質(zhì)硫辛?；揎検且环N保守的賴氨酸翻譯后修飾，只發(fā)生在涉及 TCA 循環(huán)的四種蛋白，其中就包括 DLAT。DLAT 是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體 （PDH Complex） 組分之一，丙酮酸脫氫酶可催化 TCA 循環(huán)中的丙酮酸脫羧生成乙酰輔酶 A。

　　FDX1 （一種還原酶、Elesclomol 的直接靶標(biāo)） 作為蛋白質(zhì)硫辛?；揎椀纳嫌握{(diào)節(jié)因子，一方面，參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì) （包括 DLAT） 的硫辛?；Ａ硪环矫?，F(xiàn)DX1 將 Cu2+ 還原成更具毒性的 Cu+，導(dǎo)致 Fe-S 簇蛋白合成的抑制，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

　　銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡：? 銅的穩(wěn)態(tài)主要依賴與三個銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 SLC31A1、ATP7A/B、SLC31A1，SLC31A1 負(fù)責(zé)攝入銅，ATP7A 和 ATP7B 負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)出銅。銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡與銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的機(jī)制一致。

　　圖 2. 銅死亡機(jī)制圖

　　■? 銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡

　　在這篇文章中，研究人員測試了 1448 個銅離子載體 （一種高度親脂性的 Cu2+ 結(jié)合分子，可將銅離子送入細(xì)胞），發(fā)現(xiàn)對 489 個細(xì)胞系的細(xì)胞殺傷作用 （圖 3A）。以 Elesclomol （一種高度親脂性的 Cu2+ 載體） 為例，單獨(dú)加入 Elesclomol 不影響細(xì)胞的生長，同時加入銅離子，細(xì)胞生長就會受到極大抑制，而其他金屬離子 （鐵、鈷、鋅和鎳等） 并不會影響細(xì)胞的生長 （圖 3B）。使用 NSC-319726，Disulfiram 等其它銅離子載體處理細(xì)胞也得到了相同的結(jié)果 （圖 3D-E）。

　　但使用 Tetrathiomolybdate （TTM；一種銅螯合劑） 聯(lián)合 Elesclomol 處理細(xì)胞，可以緩解 Elesclomol 對細(xì)胞的殺傷作用。這些結(jié)果表明銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡主要依賴于細(xì)胞內(nèi)銅的積累。

　　圖 3. 銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡對銅具有高度選擇性

　　A：1448 個銅離子載體對 489 個細(xì)胞系的生長抑制；B：不同金屬離子的情況下，用 Elesclomol 處理 MON 細(xì)胞；C：其他銅離子載體條件的細(xì)胞活力測定 D：使用 TTM 預(yù)處理 ABC1 細(xì)胞，然后 Elesclomol 處理

　　■? 銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡是非凋亡性的

　　有研究表明 Elesclomol 誘導(dǎo)活性氧依賴性細(xì)胞凋亡，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 Elesclomol 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡不涉及 Caspase 3 （細(xì)胞凋亡的標(biāo)志） 的切割或激活 （圖 4D-E）。并且當(dāng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)子 BAX 和 BAK1 被敲除時，以及用 Caspase 抑制劑 （Z-VAD-FMK 和 Boc-D-FMK） 處理細(xì)胞，Elesclomol 仍然維持對細(xì)胞的殺傷潛力，此外，其他已知細(xì)胞死亡機(jī)制的抑制劑處理細(xì)胞 （包括鐵死亡 （Ferrostatin-1）、壞死性凋亡 （Necrostatin-1） 和氧化應(yīng)激 （N-acetylcysteine） ），也都未能消除銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

　　這些結(jié)果表明銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡機(jī)制與細(xì)胞凋亡途徑不同。

　? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ? ? 　圖 4. 銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡不通過凋亡

　　A：ICP-MS 檢測細(xì)胞內(nèi)的銅離子和鋅離子；B：ES-Cu 處理 細(xì)胞，檢測 Caspase 3/7 的激活；C：檢測 Caspase 3 的表達(dá)；F：用 Elesclomol-CuCl2 處理 KO 細(xì)胞，檢測細(xì)胞活力；

　　■? 線粒體呼吸調(diào)節(jié)銅離子誘導(dǎo)細(xì)胞死亡

　　研究人員觀察到主要依賴線粒體呼吸的細(xì)胞對銅離子的敏感性更高 （圖 5A）。用線粒體抗氧化劑、脂肪酸和線粒體功能抑制劑等線粒體呼吸途徑相關(guān)的抑制劑處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)：電子傳遞鏈復(fù)合物的抑制劑和線粒體丙酮酸攝取抑制劑 （ UK5099 ） 處理的條件下，銅離子誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡受抑制，鐵死亡抑制劑的處理對其沒有影響 （GPX4 抑制劑 ML162 ） （圖 5B）。

　　此外，線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)劑 FCCP 處理對銅離子誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡沒有影響。這些結(jié)果表明 線粒體呼吸途徑是銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的必要條件 。

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　　研究人員還對比了缺氧條件刺激以及 FG-4592 激活缺氧誘導(dǎo)因子 （HIF） 途徑，發(fā)現(xiàn)只有真實(shí)缺氧條件會降低細(xì)胞對銅離子載體的敏感性 （圖 5D），進(jìn)一步確認(rèn)了線粒體呼吸在銅誘導(dǎo)細(xì)胞死亡中的關(guān)鍵作用。

　　隨后，研究人員分析銅離子處理對細(xì)胞耗氧率 （OCR） 的影響，結(jié)果顯示 Elesclomol 的處理會影響細(xì)胞的最大耗氧量 （圖 5E）。 這表明銅離子可能不直接影響電子傳遞鏈，而是影響三羧酸循環(huán) （TCA）。

　　圖 5. 線粒體呼吸調(diào)節(jié)銅細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞死亡

　　A-B：葡萄糖或半乳糖的條件下，檢測細(xì)胞活力；B：Elesclomol 等處理細(xì)胞，檢測細(xì)胞活力；C：FCCP 預(yù)處理細(xì)胞后用 Elesclomol 處理，檢測細(xì)胞活力；D：對照組 （21% O2）、缺氧的條件 （1% O2） 或 FG-4592 （21% O2） 條件下檢測細(xì)胞活力；E：細(xì)胞耗氧率檢測

　　■? FDX1 和蛋白硫辛?；倾~細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者

　　為進(jìn)一步闡明銅離子和 TCA 循環(huán)之間的聯(lián)系。研究人員使用 CRISPR-Cas9 技術(shù)，分別敲除不同的基因，再使用銅離子載體 （Elesclomol-copper） 處理細(xì)胞，以確定涉及參與銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的基因。

　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)有 7 個基因的敲除可以明顯緩解銅離子載體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用 （圖 6A-C），包括 FDX1，LIPT1、LIAS、DLD （硫辛酸途徑的三個關(guān)鍵酶），DLAT、PDHA1、PDHB （丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的三個組分）。另外，敲除 FDX1 和 LIAS 基因明顯減輕銅離子載體引起的細(xì)胞毒性（圖 6D-E），研究人員猜測 FDX1 有可能是蛋白質(zhì)硫辛酰化修飾的上游調(diào)節(jié)因子。

　　圖 6. FDX1 和硫辛酸途徑相關(guān)基因是銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵介質(zhì)

　　A：敲除了不同基因后，細(xì)胞參與銅離子載體誘導(dǎo)的死亡的基因 B：硫辛酸通路的示意圖；C-E：敲除 ABC1 細(xì)胞的 FDX1 和 LIAS 基因，用 Elesclomol 處理細(xì)胞，檢測細(xì)胞活力。

　　為進(jìn)一步驗(yàn)證這個假設(shè)，研究人員通過資源庫 Cancer Dependency Map，發(fā)現(xiàn) FDX1 和硫辛酸途徑相關(guān)蛋白在銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡方面是高度相關(guān)的 （圖 7A）。隨后，研究人員選取腫瘤樣本，對 FDX1 和硫辛?；鞍走M(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn) FDX1 和硫辛?；鞍妆磉_(dá)顯著相關(guān) （圖 7B-C）。敲除 FDX1 會導(dǎo)致 DLAT 蛋白和 DLST 蛋白的硫辛?；笔?（圖 7D），還會導(dǎo)致細(xì)胞呼吸水平下降 （圖 7E）。

　　此外，研究人員通過代謝物分析發(fā)現(xiàn)敲除 FDX1 會導(dǎo)致丙酮酸和 α-酮戊二酸積累和琥珀酸的的消耗。還觀察到 LIAS 的關(guān)鍵底物 S-腺苷甲硫氨酸 （SAM） 的積累。這些結(jié)果表明 FDX1 是蛋白質(zhì)硫辛?；纳嫌握{(diào)節(jié)劑 （圖 7F）。

　　圖 7. FDX1 是蛋白質(zhì)硫辛?；纳嫌握{(diào)節(jié)器

　　A：FDX1 敲除的相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)；B-C：腫瘤樣本的 FDX1 和硫辛酸的免疫組化染色；D：敲除 FDX1，檢測硫辛?；鞍椎谋磉_(dá)量；E：敲除 FDX1 基因，檢測細(xì)胞耗氧率；F：敲除 FDX1，檢測與硫辛?；緩较嚓P(guān)的代謝物的變化。

　　■? 銅直接結(jié)合并誘導(dǎo)硫辛?；?DLAT 的寡聚化

　　有研究報道銅離子與游離脂酸的離解常數(shù)為 10–17，這表明銅離子有可能直接與硫辛?；鞍捉Y(jié)合 。 為了驗(yàn)證這一猜想，研究人員純化了 DLAT 和 DLST 蛋白，發(fā)現(xiàn) DLAT 和 DLST 都可以與偶聯(lián)銅的樹脂結(jié)合 （圖 8A）。而敲除 FDX1 會導(dǎo)致 DLAT 蛋白的硫辛?；揎椣?，且 DLAT 和 DLST 也不再與偶聯(lián)銅的樹脂結(jié)合 （圖 8B）。 這表明蛋白質(zhì)的硫辛?；揎検墙Y(jié)合銅的必要條件 。此外，銅與硫辛?；鞍?DLAT 的結(jié)合，會導(dǎo)致蛋白的寡聚化。而?Elesclomol?處理會增加 DLAT 蛋白的寡聚化 （圖 8C-D）。

原文參考：http://www.activeinhibitor.com/xw/995.html

　　上述結(jié)果表明：在銅離子載體處理后硫辛?；鞍椎亩拘允怯伤鼈儺惓５墓丫圩饔媒閷?dǎo)的。此外質(zhì)譜分析還發(fā)現(xiàn)銅離子載體處理會導(dǎo)致 Fe-S 簇蛋白的水平降低 （圖 8E），這整個過程都依賴于 FDX1 蛋白的存在。

　　圖 8.? 銅直接結(jié)合硫辛酰化的 DLAT 并誘導(dǎo)其寡聚化

　　A：細(xì)胞提取蛋白和偶聯(lián)銅的樹脂的結(jié)合；B：FDX1 敲除細(xì)胞中提取蛋白和偶聯(lián)銅的樹脂的結(jié)合；C：IB 分析 DLAT 蛋白寡聚化；D: 免疫熒光共定位分析 E: Mass 分析

　　■? 銅誘導(dǎo)細(xì)胞死亡機(jī)制與銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)的遺傳模型相同

　　銅的穩(wěn)態(tài)主要依賴與三個銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白? （圖 9A）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證與銅離子載體介導(dǎo)的死亡與自然狀態(tài)下的銅紊亂的機(jī)制是否相同，研究人員過表達(dá) SLC31A1（圖 9B）。另外，過表達(dá) SLC31A1 的細(xì)胞被銅離子載體處理后蛋白硫辛酰化減少，F(xiàn)e-S 簇蛋白水平降低，HSP70 水平升高 （圖 9C）。

　　在過表達(dá) SLC31A1 的細(xì)胞中使用鐵死亡、壞死性凋亡和凋亡抑制劑不影響銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，銅螯合劑卻可緩解銅離子載體產(chǎn)生的細(xì)胞殺傷作用 （圖 9D）。老年 ATP7B 缺陷小鼠 （Atpb7b?/?，銅失調(diào)綜合征 Wilson’s disease 模型） 與雜合子 （Atpb7b+/?） 和野生型對照小鼠對比，發(fā)現(xiàn) ATP7B 缺陷小鼠的肝臟中蛋白的硫辛?；胶?Fe-S 簇蛋白的含量均有顯著降低，Hsp70 蛋白則有明顯增加 （圖 9F）。 多種模型證明銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡和銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是同一種機(jī)制 。

　　圖 9. 化學(xué)和基因誘導(dǎo)的銅依賴的細(xì)胞死亡之間具有共同的機(jī)制性

　　A：銅穩(wěn)態(tài)示意圖；B-C：過表達(dá)SLC31A1，CuCl2 處理細(xì)胞；D：用? Nec-1 等處理過表達(dá) SLC31A1 的細(xì)胞，加入 CuCl2，檢測細(xì)胞活力；E：FDX1 KO 細(xì)胞中過表達(dá) SLC31A1，加入 CuCl2 處理后檢測細(xì)胞的活力；F：檢測 Atpb7b-/- 小鼠與對照組肝臟的蛋白質(zhì)含量

　　總結(jié)：

　　這項(xiàng)研究通過利用多種死亡方式的誘導(dǎo)劑與抑制劑從多維度闡明了銅離子誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是一種新型細(xì)胞死亡即銅死亡。研究人員發(fā)現(xiàn)銅離子積累主要通過調(diào)控 FDX1 來介導(dǎo)銅死亡。

　　一方面，F(xiàn)DX1 將 Cu 2+? 還原成更具毒性的 Cu + ，可促使 TCA 循環(huán)中硫辛?；鞍桩惓９丫刍?，另一方面，F(xiàn)DX1 導(dǎo)致 Fe-S 簇蛋白的不穩(wěn)定。