文章標(biāo)題：Proteomic and clinical biomarkers for acute mountain sickness in a longitudinal cohort

發(fā)表期刊：Communications Biology（IF6.548）

發(fā)表時間：2022年6月

研究背景

急性高原?。ˋMS）是最常見的高原病之一，也是研究極端環(huán)境適應(yīng)能力的經(jīng)典模型之一。AMS的診斷依賴于問卷調(diào)查形式，并受多種不可控因素的影響。而AMS的發(fā)病機制尚不清楚，不能完全通過病理生理過程描述AMS，因此需要探索可靠的AMS生物標(biāo)志物。

研究內(nèi)容

對53名前瞻性隊列的漢族個體血漿樣本進行OLINK蛋白質(zhì)組學(xué)檢測和MRM驗證（驗證階段由青蓮百奧生物科技有限公司提供），通過差異分析、機器學(xué)習(xí)和功能關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)并證實RET在AMS的發(fā)病機制中起著重要作用?；赬GBoost模型的高精確度（AUCs>0.9），將ADAM15、PHGDH和TRAF2分別作為保護性、預(yù)測性和診斷性生物標(biāo)志物，為深入探討AMS疾病的致病機制，進一步理解平原人群對高海拔環(huán)境的適應(yīng)性提供了一定的依據(jù)。

研究思路

olink+質(zhì)譜法的MRM完美結(jié)合是發(fā)現(xiàn)驗證疾病biomarker的重要手段。

結(jié)果速遞

01?基于PEA的發(fā)現(xiàn)階段和AMS相關(guān)蛋白質(zhì)的鑒定

在發(fā)現(xiàn)階段，測量了10個AMS包括1k和4k中受試者中的1069個蛋白質(zhì)，基于q值<0.05，確定了47種差異表達(dá)蛋白（DEP），其中包括40種上調(diào)蛋白和7種下調(diào)蛋白，差異蛋白可以清楚區(qū)分AMS1k和AMS4k組，通過對上調(diào)和下調(diào)蛋白進行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)能量代謝途徑，如氮代謝、戊糖磷酸途徑和糖酵解/糖異生，在Cluster2中顯著下調(diào)，而在Cluster1中，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和TNF信號途徑顯著上調(diào) ?？偟膩碚f，參與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用途徑的三種細(xì)胞因子，即IL6受體家族（LEPR）、IL-1受體家族（IL18R1）和TGF-β家族（GDF15及INHBC）均上調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明，免疫和炎癥反應(yīng)以及能量代謝積極參與了AMS的發(fā)病機制。

02?通過多反應(yīng)監(jiān)測MRM進行驗證

為了證實PEA鑒定的DEPs和AMS之間的關(guān)聯(lián)，使用MRM技術(shù)分析了53名中國漢族男性受試者53對血漿樣本（30個AMS4k、30個AMS1k、23個nAMS4k和23個nAMS1k）中的102種蛋白質(zhì)（添加55種參與磷酸戊糖和糖酵解途徑多種途徑的蛋白質(zhì)，將47種蛋白質(zhì)擴展到102種蛋白質(zhì)）。

2.1參與AMS發(fā)病機制的關(guān)鍵蛋白

AMS4k和AMS1k組47種蛋白質(zhì)中有23種（49%）呈現(xiàn)出與PEA鑒定的DEPs一致的變化趨勢。在這些蛋白質(zhì)中matrilin 3 (MATN3)、myocilin (MYOC)、ret protooncogene(RET)和S100 calcium binding protein A12 (S100A12)?存在顯著差異，MYOC參與細(xì)胞骨架功能，MATN3促進HIF-1α途徑中的主要因子HIF-1α31的表達(dá)，以應(yīng)對缺氧和炎癥，S100A12是一種鈣、鋅和銅結(jié)合蛋白，在炎癥過程和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，這驗證了它們可能參與對AMS的反應(yīng)。值得注意的是，RET在nAMS4k和nAMS1k之間顯示出相反的變化趨勢，盡管這種差異在統(tǒng)計學(xué)上并不顯著。此外，經(jīng)MRM鑒定的DEPs富集到了HIF-1信號通路、糖酵解/糖異生和碳代謝等信號通路。

2.2參與AMS發(fā)病機制的保護蛋白

nAMS4k組和nAMS1k組之間的比較可用于探索保護相關(guān)蛋白。nAMS4k和nAMS1k組之間發(fā)現(xiàn)29個保護性DEPs?？偟膩碚f，這兩組之間ADAM metallopeptidase?domain 15 (ADAM15)、CD38 molecule (CD38)、cystatin E/M(CST6)、KIT ligand (KITLG)、thrombomodulin (THBD)趨勢與AMS4k和AMS1k組之間趨勢相反，這表明它們在預(yù)防AMS和快速適應(yīng)高海拔環(huán)境方面具有潛在的保護作用。其中，ADAM15下調(diào)表達(dá)程度最大。

2.3AMS的預(yù)測性生物標(biāo)志物

AMS1k和nAMS1k組之間的比較可以識別預(yù)警生物標(biāo)志物。在AMS1k和nAMS1k組之間確定了23個DEPs，其中17個DEPs顯示出與AMS4k和nAMS4k組之間獲得相同的趨勢，顯示了這些蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性?；趌og2FC的絕對值大于0.5的篩選得到6種上調(diào)蛋白：phosphoenolpyruvate carbox-ykinase 1 (PCK1)、phosphoglycerate dehydrogenase (PHGDH)、ribokinase (RBKS)、S100A12、solute carrier family 4 member 1(SLC4A1)、secreted protein acidic and cysteine rich (SPARC)。在這些DEPs中，PCK137和RBKS參與碳水化合物的代謝。這些結(jié)果表明，這些蛋白是AMS的候選預(yù)警生物標(biāo)志物。

2.4AMS診斷生物標(biāo)志物

AMS4k和nAMS4k組之間的比較可用于發(fā)現(xiàn)AMS的診斷生物標(biāo)志物。兩組比較發(fā)現(xiàn)28個DEPs?；趌og2FC絕對值進行過濾后，10種上調(diào)蛋白（ARF6、EBI3、ISLR2、MYOC、NRP2、RBKS、RET、TRAF2、WAP、WFIKKN1）等仍然存在。在這些蛋白質(zhì)中，EBI3、RET和WFIKN1與AMS1k和nAMS1k組之間的比較結(jié)果顯示出相反的調(diào)節(jié)趨勢，這表明它們更可能成為診斷生物標(biāo)記物。值得注意的是，RET在AMS4k組和AMS1k組之間表現(xiàn)出相同的調(diào)節(jié)趨勢，表明其在AMS發(fā)病機制中起著積極作用。

03?機器學(xué)習(xí)進行AMS分類表征

XGBoost機器學(xué)習(xí)模型在區(qū)分AMS4k和AMS1k、nAMS4k和nAMS1k、AMS4k和nAMS4k以及AMS1k和nAMS1k方面表現(xiàn)出良好的性能。本研究使用了10倍交叉驗證和MRM鑒定的DEPs來增強模型的穩(wěn)健性和性能。

區(qū)分AMS1k和AMS4k組的發(fā)病機制模型中，篩選出7種重要蛋白質(zhì)（RET、ISLR2、MATN3、SCARA5、CA2、MYOC和S100A12），模型的曲線下面積（AUC）為0.90。值得注意的是，根據(jù)差異豐度分析，RET、MYOC、MATN3和S100A12也是候選的發(fā)病相關(guān)蛋白。區(qū)分nAMS1k和nAMS4k的保護模型中，篩選得出5種重要蛋白質(zhì)（ISLR2、MYOC、WFIKN1、SCARA5和ADAM15），模型的AUC為0.95，這表明這些蛋白質(zhì)可能參與在高海拔地區(qū)減輕無AMS個體的AMS癥狀。其中，ADAM15在差異豐度分析中被認(rèn)定為一種重要的候選保護蛋白。因此，ADAM15可以作為預(yù)防和治療AMS的候選靶點。區(qū)分AMS1k和nAMS1k的預(yù)警模型中篩選得出8種重要蛋白質(zhì)（PHGDH、UBA1、RBK、GNA13、IGFBP7、FCN2、CA2、V-set和VSIG4），模型的AUC為0.91（p值=0.001）。通過差異豐度分析，PHGDH和RBK也被確定為潛在的預(yù)警生物標(biāo)志物，用于評估個體在上升到高海拔之后，AMS的發(fā)生情況。尤其是參與葡萄糖/能量代謝的PHGDH，其重量是模型中其他蛋白質(zhì)的四倍。區(qū)分AMS4k和nAMS4k的診斷模型中篩選出13種重要蛋白質(zhì)（TRAF2、AGT、IL18R1、THY1、ISLR2、TCN2、CD38、GNA14、INHBC、GC、RBKS、WFIKN1和ARF6），模型的AUC為0.89，這表明這些蛋白質(zhì)具有作為AMS診斷生物標(biāo)志物的潛在價值。通過差異分析，TRAF2、GC和WFIKN1也被確定為候選診斷生物標(biāo)志物。綜上，此研究建立了穩(wěn)健的機器學(xué)習(xí)模型，很好地區(qū)分了這些比較組，并提供了四組候選生物標(biāo)志物。

04?AMS的關(guān)鍵臨床指標(biāo)

利用差異臨床指標(biāo)，構(gòu)建機器學(xué)習(xí)模型，以區(qū)分AMS4k與AMS1k、nAMS4k與nAMS1k、AMS4k與nAMS4k以及AMS1k與nAMS1k。在區(qū)分AMS1k和AMS4k的發(fā)病機制模型中，有19個臨床指標(biāo)（如如A-TPO、C-peptide、phosphate、E2、CKMB和thyroxine）分類準(zhǔn)確率非常高（AUC=0.96，p值<0.0001）。保護模型中用16項臨床指標(biāo)（FT3、ferritin、free?Prostate-specific antigen (FPSA)、creatinine、C3C和?FSH）區(qū)分nAMS1k和nAMS4k，AUC為0.94（p值<0.001）。預(yù)警和診斷模型分別篩選得到3個臨床指標(biāo)（proBNP、BILT和?thyrotropin）和4個臨床指標(biāo)（procalcitonin、TP1NP、C-peptide和insulin），AUC分別為0.67和0.7（p值>0.05）。臨床指標(biāo)在預(yù)測和診斷AMS方面的表現(xiàn)似乎不如蛋白質(zhì)。

在預(yù)測和診斷模型中，單獨使用蛋白質(zhì)和組合數(shù)據(jù)獲得的分類性能相似。值得注意的是，與使用組合數(shù)據(jù)獲得的預(yù)警模型相比，單獨使用蛋白質(zhì)獲得的預(yù)警模型中保留的特征更少。此外，利用組合數(shù)據(jù)獲得的診斷模型中，所有重要特征都是蛋白質(zhì)。因此，在預(yù)測和診斷AMS時，蛋白質(zhì)是比臨床指標(biāo)更好的選擇。

05?AMS個體間碳水化合物代謝相關(guān)蛋白的變化

在低海拔地區(qū)，患AMS的個體比未患AMS的個體對糖異生的利用率更高。糖異生的兩個關(guān)鍵酶G6PC和PCK1在AMS1k組中的豐度高于nAMS1k組。在高海拔地區(qū)，患有AMS的個體可能比未患AMS的個體表現(xiàn)出更高的糖酵解利用率，研究發(fā)現(xiàn)AMS4k中的PFKM是糖酵解的關(guān)鍵限速酶，其水平高于nAMS4k，這將導(dǎo)致產(chǎn)生更多的1,6-二磷酸果糖，從而刺激糖酵解。其次，AMS個體乳酸脫氫酶A（LDHA）和ALDOA水平高于未患AMS個體，二者參與糖酵解和糖異生，糖異生相關(guān)酶PCK1和G6PC在AMS4k和未患AMS4k之間表現(xiàn)出相似的表達(dá)水平。因此，推測AMS4k組的糖酵解而非糖異生比nAMS4k組更活躍。

在低海拔和高海拔地區(qū)，患有AMS的個體可能比未患AMS的個體具有更活躍的TCA循環(huán)。盡管在兩組個體中，在上升到高海拔后都發(fā)現(xiàn)TCA循環(huán)受到抑制，但PDHA1在患有AMS的個體中的水平仍然高于未患AMS的個體?；加蠥MS的個體在低海拔地區(qū)可能表現(xiàn)出更強的糖異生能力，在高海拔地區(qū)的糖原利用率和糖酵解率可能高于未患有AMS的個體。在上升到高海拔后，所有個體的TCA循環(huán)都受到抑制，而患有AMS的個體的TCA循環(huán)比未患有AMS的個體更活躍。綜上，不同的碳水化合物代謝途徑在適應(yīng)高海拔環(huán)境中起著關(guān)鍵作用。

06?蛋白質(zhì)、臨床指標(biāo)和AMS癥狀表型之間的關(guān)聯(lián)

對53名低海拔或高海拔人群的臨床指標(biāo)、蛋白質(zhì)和AMS癥狀表型之間的相關(guān)性分析表明，有助于了解AMS的致病機理、預(yù)警或診斷。未發(fā)現(xiàn)AMS1k和nAMS1k之間的差異特征與AMS癥狀表型相關(guān)。然而，在AMS1k和nAMS1k之間發(fā)現(xiàn)促甲狀腺素與葡萄糖/能量代謝相關(guān)蛋白PCK1、PHGDH和IGFBP7之間存在聯(lián)系。促甲狀腺素和PLA2G7的單核苷酸多態(tài)性分別與血壓變化和高血壓相關(guān)。此外，在AMS4k組和nAMS4k組之間，包括FGF23、RET、IL18R1和GNA14在內(nèi)的蛋白質(zhì)與AMS癥狀表型（如食欲不佳、呼吸困難和唇發(fā)紺）呈正相關(guān)，而非臨床指標(biāo)。此外，C-peptide與13種蛋白質(zhì)呈正相關(guān)，例如候選致病相關(guān)蛋白MYOC（ρ=0.42，q值<0.05）、KITLG（ρ=0.27，q值<0.05）和診斷生物標(biāo)記物TRAF2（ρ=0.36，q值<0.05）。因此，C-peptide可能參與AMS的發(fā)病機制，而我們研究的臨床指標(biāo)在預(yù)測和診斷AMS方面的表現(xiàn)并不優(yōu)于蛋白質(zhì)。

總結(jié)：

使用Olink的PEA技術(shù)分析了10名低海拔和高海拔AMS患者的1069種蛋白質(zhì)，并鑒定了47種AMS相關(guān)蛋白質(zhì)。使用基于MS的MRM技術(shù)，在53名有或無AMS的低海拔和高海拔個體中驗證了102種蛋白質(zhì)。PEA和MRM的結(jié)合可以在很大程度上避免假陽性，提高候選生物標(biāo)志物的質(zhì)量。系統(tǒng)地分析了可能參與AMS發(fā)病機制、保護、預(yù)測和診斷的蛋白質(zhì)和臨床指標(biāo)，以確定候選治療靶點和生物標(biāo)志物。最后，分析了同一隊列中的22個AMS癥狀表型和65個臨床指標(biāo)，并確定了AMS相關(guān)蛋白、表型和臨床指標(biāo)之間的強相關(guān)性，這為使用蛋白質(zhì)和臨床指標(biāo)精確重新定義AMS提供了基礎(chǔ)。