前言

結(jié)直腸癌 (CRC) 是一種常見的胃腸道惡性腫瘤，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第三。目前已有證據(jù)表明術(shù)后放療可以減少局部復(fù)發(fā)、提高生存率。然而，在臨床實踐中，對放療敏感性的個體差異很大，因此尋找新的生物標(biāo)志物來預(yù)測放療敏感性，制定個性化策略具有十分重要的意義。

2022年8月17日，蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院（常州市第一人民醫(yī)院）蔣敬庭教授為通訊作者，在Cell Death Differentiation(IF: 12.067)雜志上在線發(fā)表題為“A novel long noncoding RNA SP100-AS1 induces radioresistance of colorectal cancer via sponging miR-622 and stabilizing ATG3”的研究論文，發(fā)現(xiàn)了lncRNA SP100-AS1在調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞增殖和放射敏感性中的作用，為探索CRC潛在的生物標(biāo)志物及其可能的調(diào)控機(jī)制提供參考。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

1、SP100-AS1上調(diào)表達(dá)與CRC放療抵抗相關(guān)

通過全轉(zhuǎn)錄組測序分析了放療敏感和放療抵抗患者的lncRNA表達(dá)譜變化，發(fā)現(xiàn)lncRNA SP100-AS1在放療抵抗患者中顯著高表達(dá)(圖 1)。與正常上皮細(xì)胞系相比，SP100-AS1在CRC細(xì)胞系中顯著高表達(dá)，尤其是HCT116和SW480。此外發(fā)現(xiàn)SP100-AS1高表達(dá)的CRC患者的總生存率偏低(圖 1)。綜上所述，lncRNA SP100-AS1高表達(dá)與CRC患者的放療抵抗和低生存率相關(guān)。

圖1 | SP100-AS1在結(jié)直腸癌中高表達(dá)

2、SP100-AS1敲除增強了CRC的放療敏感性? ??

作者探究了SP100-AS1對CRC細(xì)胞增殖和放療敏感性的影響。抑制SP100-AS1表達(dá)時，HCT116和SW480細(xì)胞的放療敏感性顯著增加，細(xì)胞增殖水平和細(xì)胞活力顯著下降，并且誘導(dǎo)了DNA損傷的重要標(biāo)志物 γ-H2AX的表達(dá)，顯著增加了HCT116細(xì)胞的凋亡(圖 2)。SP100-AS1參與了輻射誘導(dǎo)的DNA損傷和細(xì)胞凋亡，且SP100-AS1敲除可提高CRC的放療敏感性。

圖2 | SP100-AS1敲除加劇了放療誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡

3、SP100-AS1在體內(nèi)具有顯著的放療抵抗性? ??

裸鼠移植瘤實驗表明，SP100-AS1敲除的HCT116細(xì)胞生長較慢，且在2 Gy輻射下，SP100-AS1敲除的HCT116細(xì)胞生長更為緩慢(圖 3)。在2 Gy輻射下，敲除SP100-AS1會誘導(dǎo)更嚴(yán)重的DNA損傷，表明SP100-AS1敲除抑制了CRC腫瘤細(xì)胞的生長，特別是在輻射暴露下(圖 3)。綜上，SP100-AS1敲除可以提高CRC的體內(nèi)外放療敏感性。

圖 3 | SP100-AS1敲除抑制CRC細(xì)胞生長

4、SP100-AS1通過自噬途徑增加結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的放療抵抗活性

為了探究自噬途徑是否參與了抗輻射過程，作者分析了LC3-II和p62/SQSTM1等蛋白在敲除SP100-AS1細(xì)胞系中的表達(dá)情況。敲除SP100-AS1后，LC3-II表達(dá)下調(diào)，p62表達(dá)上調(diào)；放療處理后，LC3-II表達(dá)下調(diào)，p62表達(dá)上調(diào)，說明自噬作用明顯減弱(圖 4)。WB和IHC分析表明，IR治療后的CRC移植瘤中p62表達(dá)顯著降低，LC3-II表達(dá)顯著升高，而SP100-AS1敲除逆轉(zhuǎn)了這一趨勢。綜上，輻射可以誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞的自噬，而敲除SP100-AS1則可以緩解這一作用。

圖4 | SP100-AS1通過自噬調(diào)控HCT116細(xì)胞增殖

5、SP100-AS1通過ATG5和Beclin1調(diào)控自噬通路

有報道稱ATG5和Beclin1可直接激活自噬信號通路，因此作者探究了過表達(dá)ATG5和Beclin1能否挽救SP100-AS1介導(dǎo)的自噬?；貜?fù)實驗表明：因SP100-AS1敲除所誘導(dǎo)的自噬下調(diào)可以通過上調(diào)ATG5或Beclin1來挽救(圖 5)。此外，上調(diào)ATG5和Beclin1，可以降低SP100-AS1敲除誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(圖 5)。這些結(jié)果表明，ATG5或Beclin1的上調(diào)，都可以挽救因SP100-AS1下調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞增殖下降。

圖5 | 過表達(dá)ATG5和Beclin1均挽救了SP100-AS1介導(dǎo)的自噬

6、SP100-AS1與ATG3相互作用并調(diào)節(jié)其蛋白穩(wěn)定性

通過質(zhì)譜鑒定和pull-down找到了一個可以與SP100-AS1特異性結(jié)合的蛋白ATG3(圖6)。有研究表明蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性會受到泛素化依賴的蛋白酶體降解信號通路的調(diào)控，因此作者探究了SP100-AS1是否通過泛素化依賴的蛋白酶體通路調(diào)控ATG3的穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)SP100-AS1敲除增加了ATG3的泛素化水平從而介導(dǎo)ATG3的降解，表明SP100-AS1通過泛素化介導(dǎo)ATG3的降解(圖 6)。上述結(jié)果表明了SP100-AS1可以與ATG3特異互作來調(diào)控其蛋白穩(wěn)定性。

圖6 | SP100-AS1與ATG3相互作用來調(diào)節(jié)其蛋白穩(wěn)定性

7、SP100-AS1可以與miR-622靶向結(jié)合來發(fā)揮其調(diào)控作用

為了進(jìn)一步研究SP100-AS1調(diào)控ATG3表達(dá)的機(jī)制，作者觀察了SP100-AS1是否可以作為ATG3 mRNA的miRNA海綿來發(fā)揮其調(diào)控作用。在HCT116和SW480細(xì)胞系中均檢測到AGO2和SP100-AS1互作，同時發(fā)現(xiàn)SP100-AS1可以與miR-622互作，且突變的SP100-AS1 3‘UTR不能與miR-622相互作用(圖 7)。以上結(jié)果表明SP100-AS1可以作為miR-622海綿發(fā)揮作用。證實了miR-622可以直接與SP100-AS1靶向結(jié)合，并影響其在CRC細(xì)胞中的mRNA 穩(wěn)定性。

圖7 | SP100-AS1作為miR-622的海綿發(fā)揮作用

8、miR-622靶向ATG3 mRNA調(diào)節(jié)自噬

作者繼續(xù)探究了miR-622對自噬通路的影響。發(fā)現(xiàn)SP100-AS1過表達(dá)后，p62的表達(dá)下調(diào)，LC3-II的表達(dá)上調(diào)，而miR-622過表達(dá)后則相反。在SP100-AS1過表達(dá)的細(xì)胞系中異位表達(dá)miR-622，可恢復(fù)p62和LC3-11的表達(dá)(圖 8)。因此作者猜測SP100-AS1可以作為miR-622的海綿，阻止其對ATG3 mRNA的影響，從而穩(wěn)定ATG3表達(dá)，促進(jìn)自噬。為了驗證這一猜想，進(jìn)行了一系列試驗。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-622可以降低WT熒光素酶的表達(dá)，而與SP100-AS1共轉(zhuǎn)染則可以挽救熒光素酶的活性，且共轉(zhuǎn)染攜帶突變的ATG3 3‘UTR區(qū)域的質(zhì)粒并不能恢復(fù)熒光素酶活性。此外，miR-622顯著降低了ATG3的表達(dá)，而與SP100-AS1共表達(dá)可以恢復(fù)ATG3的表達(dá)，敲除SP100-AS1也可以降低ATG3中mRNA的水平(圖 8)。證實SP100-AS1是CRC放療抵抗的關(guān)鍵調(diào)控因子，作為miR-622的海綿，維持ATG3的穩(wěn)定表達(dá)。

圖8 | SP100-AS1通過與miR-622相互作用調(diào)控ATG3的表達(dá)

研究結(jié)論

本研究通過全轉(zhuǎn)錄組測序分析，在放療抵抗的CRC患者組織中找到表達(dá)上調(diào)的lncRNA SP100-AS1，敲除SP100-AS1會顯著降低體外和體內(nèi)的放療抵抗、細(xì)胞增殖和腫瘤形成。采用質(zhì)譜和生信分析發(fā)現(xiàn)與SP100-AS1互作的特異蛋白ATG3及miRNA miR-622。此外，研究發(fā)現(xiàn)SP100-AS1通過泛素化依賴的蛋白酶體途徑可以與ATG3蛋白互作并穩(wěn)定其表達(dá)，同時還可以作為miR-622的海綿，靶向ATG3 mRNA，影響自噬活性。綜上所述，本研究表明SP100-AS1/miR-622/ATG3調(diào)控CRC的放療抵抗和自噬活性。

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