多能干細胞可分化為各種細胞并構(gòu)成成熟生物。這些細胞可以在體外培養(yǎng)，稱為胚胎干細胞（ESCs）。 ESC在發(fā)育生物學上經(jīng)歷了一場巨大的革命。這些體外生長的ESCs具有在體內(nèi)產(chǎn)生胚胎所有譜系的潛力，并且在體外分化后可以產(chǎn)生任何類型的體細胞，例如心肌細胞，平滑肌細胞，內(nèi)皮細胞，神經(jīng)元細胞和肝細胞。與其他細胞類型相比，胚胎干（ESC）細胞的優(yōu)勢在于它們易于進行基因操作。它們可以很容易地進行基因修飾，同時保持多能性，并且可以選擇性地增殖。人類ESC作為治療許多退化性疾?。ɡ缛毖孕牧λソ撸两鹕喜?，阿爾茨海默氏病，糖尿病，脊髓損傷和年齡相關性黃斑變性）的寶貴細胞來源而受到歡迎。在2010年，首次使用人類胚胎干細胞治療脊髓損傷，并在此之后對人類胚胎干細胞進行了十幾項臨床試驗，以治療嚴重的缺血性左心室功能不全，年齡相關性黃斑變性，帕金森氏病和糖尿病以及其他退化性疾病。

然而，基于人類ESC的臨床試驗極大地受到了限制，例如關于使用胚胎來源細胞的倫理問題，以及是用操作不當培養(yǎng)的干細胞而導致異常發(fā)育，以及移植排斥反應。Takahashi和Yamanaka（2016）在將體細胞重編程為多能狀態(tài)方面取得了突破性發(fā)現(xiàn)。在他們的研究中，通過強迫異位表達轉(zhuǎn)錄因子OCT4，SOX2，KLF，c-MYC，NANOG和LIN28，重編程了諸如皮膚活檢來源的成纖維細胞和外周血來源的T淋巴細胞等體細胞。這些細胞被稱為誘導多能干細胞（iPSC），表現(xiàn)出相似的基因表達，表觀遺傳學特征和分化潛能，可與ESC一樣，產(chǎn)生任何體細胞。

應用范圍：

ESC和iPSC在生物醫(yī)學研究中有著廣泛的應用。

1. 基礎研究：了解cell fate control和細胞再生，研究多能性、組織和器官發(fā)育、生理學。

2. 藥物發(fā)現(xiàn)：用于心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和神經(jīng)精神疾病、罕見病等疾病的藥物研發(fā)

3. 毒理學研究：在毒性測試中使用iPSC衍生的細胞類型。

4. 疾病建模：心血管疾病模型、iPSC在心血管疾病模型中的利用率百分比、iPSC來源在心臟研究中的比例、用于重編程的載體類型的比例、用于疾病建模的分化心肌細胞的比例、iPSC衍生的類器官開發(fā)和疾病、使用iPSC衍生的肝細胞、神經(jīng)退行性疾病建模中的iPSC、癌癥衍生的iPSC來建模肝臟疾病。

5. 基于細胞的療法：用于AMD的細胞療法，如自體iPSC-RPE和異源iPSC-RPE，用于帕金森氏病的iPSC衍生的多巴胺能神經(jīng)元，用于實體癌的iPSC衍生的NK細胞，用于GvHD的iPSC衍生的細胞，iPSC衍生的細胞用于脊髓損傷，iPSC衍生的心肌細胞用于缺血性心肌病。

CRISPR-U?基因編輯ESC和iPSC

CRISPR系統(tǒng)是一種有效的基因組編輯系統(tǒng)，可通過將目標基因序列替換為所需的供體序列來進行基因敲除或敲入基因組操作。CRISPR系統(tǒng)可以產(chǎn)生單個或多個基因敲除，正確的突變或插入報道基因轉(zhuǎn)基因。用CRISPR介導的ESC和iPSC的基因編輯，可用于探索譜系選擇，分化和干細胞命運的遺傳決定因素，從而使研究人員能夠研究各種基因或非編碼元件如何促進特定的過程和途徑。?ESC和iPSC細胞模型中的基因組編輯可以在功能基因組學，信號通路，藥物發(fā)現(xiàn)，藥物反應，癌癥研究和細胞治療等領域推進研究計劃。

為了加速ESC和iPSC的研究，Ubigene開發(fā)了CRISPR-U?用于ESC和iPSC的基因操作。因此，通過利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在ESC和iPSC中實現(xiàn)基因組編輯。CRISPR-U?系統(tǒng)用于在ESC和iPSC中進行快速，精確的基因編輯。CRISPR生成的細胞模型已使各種疾病的機制和治療探索成為可能，例如心血管疾病，肝病等。此外，CRISPR生成的細胞模型可與藥物發(fā)現(xiàn)，安全藥理學和其他治療研究相結(jié)合。Ubigene可以自定義ESC和iPSC中的基因編輯，并且可以在動物模型中生成各種基因修飾。

圖：針對工程ESC和iPSC的CRISPR-U?定制流程

基因敲除iPSC的研究案例：

缺失I類HLA的血小板可以逃避自然殺傷細胞的免疫力

血小板輸注是血小板減少癥患者的基本治療方法。接受血小板輸注的患者中約有5％–15％觀察到同種免疫血小板輸注的難治性（allo-PTR），最主要的原因是產(chǎn)生了針對人類白細胞抗原I類（HLA-1）的同種抗體。在這種HLA-1介導的同種異體PTR中，除了與HLA-1相容的血小板外，輸血的血小板被立即排斥。但是，選擇兼容供體的需求限制了供應，最困難的情況是罕見的HLA-1型。作為產(chǎn)生人細胞和組織的離體來源，已經(jīng)廣泛研究了人誘導的多能干細胞（iPSC），并且iPSC衍生的血小板（iPLAT）具有解決當前輸血系統(tǒng)中上述問題的潛力。在本研究中，CRISPR/Cas9介導的HLA-KO iPLAT通過敲除HLA-1復雜分子β2-微球蛋白（B2M）產(chǎn)生。選擇B2M的外顯子1作為敲除靶標。對于KO B2M，研究人員構(gòu)建了sgRNA表達載體（pHL-H1-B2M-sgRNA-mEF1a-RiH），CRISPR / Cas9表達載體（pHL-UbicP-SphcCas9-iP-A）并轉(zhuǎn)染了MK-iPSC以生成HLAKO iPLAT。 HLA-KO iPLAT對所有HLA-1均缺乏，但在體外未引起NK細胞的細胞毒性反應，并且在用人NK細胞重建的人源化小鼠模型（Hu-NK-MSTRG）中輸注后，其循環(huán)量相當于野生型iPLAT 。這項研究揭示了血小板獨特的非免疫原性，并為HLA-KO iPLAT的臨床應用提供了概念證明。

圖1：通過在imMKCL中敲除β2-微球蛋白生產(chǎn)HLA-KO iPLAT。?首先將imMKCL重新編程為次級MK-iPSC，其中B2M被敲除。增殖并發(fā)展成熟的MK-iPSC之后，iPLAT中敲除B2M（A，B）。流式細胞儀分析生成的CD41a + CD42b + iPLAT，以及imMKCL，iPLAT，JRC血小板和K562細胞（C，D和E）上B2M和HLA-ABC和HLA-E的細胞表面表達。

基因點突變iPSC的研究案例：

通過CRISPR/Cas9和iPS細胞研究如何糾正隱性營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解

營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥（DEB）是一種罕見的遺傳性皮膚脆弱性疾病，其特征是皮膚和粘膜起泡，可以以顯性（DDEB）或隱性（RDEB）方式遺傳。 DEB是由編碼VII型膠原（C7）的COL7A1基因突變引起的，該蛋白是形成錨定纖絲（AFs）的關鍵蛋白，該錨定纖絲可以穩(wěn)定基底膜區(qū)（BMZ）的表皮粘附。 RDEB患者缺乏功能性C7，嚴重損害了皮膚-表皮的穩(wěn)定性，導致皮膚上廣泛的水皰和開放性傷口，極大地影響了患者的生活質(zhì)量。目前尚無批準用于治療RDEB的療法。研究人員使用CRISPR系統(tǒng)對來自雜合和純合狀態(tài)的RDEB患者的誘導多能干細胞（iPSC）進行了修飾，并糾正了COL7A1基因中第19外顯子（c.2470insG）和第32外顯子（c.3948insT）的突變。通過同源性導向修復（HDR）。他們發(fā)現(xiàn)，通過基因校正的iPSC可以產(chǎn)生三維人皮膚等效物（HSE），將其分化為角質(zhì)形成細胞（KCs）和成纖維細胞（FBs），然后移植到免疫缺陷小鼠上，該小鼠在BMZ以及C7處均能正常表達C7。移植后2個月恢復房顫。這些發(fā)現(xiàn)代表了針對RDEB的基于創(chuàng)新自體干細胞療法的臨床應用的關鍵進展。這一發(fā)現(xiàn)可以作為將這種治療方法轉(zhuǎn)化為臨床的基礎。

CRISPR/Cas9質(zhì)粒方法和RNP方法對COL7A1基因純合和雜合突變的雙等位基因校正

研究人員采用了兩種CRISPR介導的基因組編輯方法來校正iPSCs純合和雜合狀態(tài)下的COL7A1基因突變。他們使用CRISPR/Cas9質(zhì)粒法在純合iPSC中應用了雙等位基因校正。他們評估了iPSC衍生細胞中COL7A1基因第19外顯子的基因校正功效。他們發(fā)現(xiàn)，外顯子19中的COL7A1突變中有10％的克隆經(jīng)過了雙等位基因校正，而40％的克隆已進行了單等位基因校正。序列分析表明目標序列區(qū)域無脫靶突變。為了提高校正效率，研究人員使用了Cas9蛋白和經(jīng)過化學修飾的合成gRNA作為RNP復合物。通過RNP方法，他們對COL7A1第19外顯子的純合突變（c.2470insG）實現(xiàn)了58%的雙等位基因校正和42%的單等位基因校正，對COL7A1第19外顯子和第32外顯子的雜合突變（c.2470insG/c.3948insT）分別實現(xiàn)了19%的雙等位基因和48%的單等位基因校正。此策略可構(gòu)建“無痕”表型而不會留下殘留足跡，并在單個iPSC中產(chǎn)生非常高的效率，而沒有脫靶問題。

圖2.在iPS細胞中使用基于質(zhì)粒和蛋白質(zhì)的方法評估CRISPR / Cas9基因校正效率。 （A）COL7A外顯子19中純合（c.2470insG）突變的CRISPR靶位的示意圖。 （B）用于基于質(zhì)粒的基因校正策略的組件。 （C）基因編輯靶向COL7A1基因的外顯子19后的T7E1測定。 （D）桑格測序證實了各種基因型。 （E）COL7A外顯子19中雜合（c.2470insG / c.3948insT）突變的CRISPR目標位點的示意圖。 （F）用于基于蛋白質(zhì)的基因校正策略。 （G）測序證實了各種基因型。 （H）CRISPR / Cas9基因編輯后檢測到的基因型和功效概述。

裸鼠移植后的皮膚完整性和VII型膠原修復

研究人員建立了從RDEB患者來源的iPSC生成角質(zhì)形成細胞（iKC）和成纖維細胞（iFBs）的方案。他們觀察到功能性iKC需要60天才能體外成熟，并且96％的iPSC衍生的KC（iKC）表達角蛋白14，而96％的50％的p63表達水平很高。除此之外，他們在分化31天后從iPSC獲得了iFB。他們觀察到超過90％的iPSC衍生的iFB具有與正常人FB一致的表達模式。然后將來自基因校正的iKC和iFB的3D皮膚移植到免疫缺陷小鼠上，并在移植后2個月進行分析。他們分析了C7，表皮分化標記物（如角蛋白14，角蛋白10，loricrin，絲聚蛋白和波形蛋白）的表達。?iPSC來源的校正異種移植物表達C7，完全類似于WT皮膚，表明基因校正恢復了iPSC來源的iKC和iFB中的蛋白質(zhì)功能。

圖3.基因校正的RDEB患者iPSC衍生的FB和HSE的功能驗證。 （A）免疫印跡（WB）分析評估VII型膠原（C7）蛋白在正常人FB，野生型iPSC衍生的FB（iPSC WT FB），COL7A1-RDEB純合突變體（-/-）中的表達和分泌并進行了校正（+ / +）iPSC分化為FB。 （B）（C）在升高的溫度下，通過有限的胰蛋白酶消化正常人FB和iPSC基因校正的RDEB衍生的FB的培養(yǎng)基，分析和定量C7的熱穩(wěn)定性。 （D）使用基因校正的RDEB患者iPSC衍生的KCs和FBs進行3D HSE的生成，然后將其移植到裸鼠上，在組織學上可與移植后2個月使用iPSC WT KCs / FBs生成的3D HSEs進行組織學比較。 H＆E染色顯示正常的表皮和真皮形態(tài)。在移植后2個月，使用LH7.2抗體通過免疫熒光（IF）染色（綠色信號）證明了C7的沉積。在校正的，突變的和WT異種移植物上對角蛋白14，角蛋白10，loricrin，絲蛋白和波形蛋白進行額外的IF染色。 （E）在移植后2個月，對陽性iPSC WT KCs / FBs皮膚移植物，陰性COL7A1-RDEB純合突變體和COL7A1-RDEB基因校正的KCs / FBs皮膚移植物以及基因校正的RDEB皮膚移植物進行透射電子顯微鏡檢查。 BMZ由黑色箭頭指示。

基因敲入iPSC的研究案例：

CRISPR介導的LGMD2A的新型自體細胞療法

肢帶型肌營養(yǎng)不良癥2A型（LGMD2A）是常染色體隱性遺傳性疾病，是LGMD的最常見形式。 LGMD2A的發(fā)生是由于功能性鈣蛋白酶3（CAPN3）的喪失，鈣蛋白酶敏感性鈣蛋白酶半胱氨酸蛋白酶家族是骨骼肌特異性同種型。研究人員使用CRISPR/Cas9介導的基因組編輯技術對三位LGMD2A患者的iPSC進行了校正，以糾正CAPN3基因中的突變。?CRISPR介導的基因敲入方法用于編輯攜帶三個不同CAPN3突變的iPSC基因組，并在體外拯救肌管衍生物中的CAPN3蛋白。為了糾正該突變，研究人員使用了靶向克隆到pX458載體中的CAPN3-外顯子14（50 -CATCTCCGTGGATCGGCCAG-30）的指導RNA序列。在pBluescript質(zhì)粒主鏈中構(gòu)建HDR供體載體，其中帶有由HEF1-eIF4g驅(qū)動的loxP側(cè)翼GFP-2A-neoR的選擇盒用于陽性選擇，而由MC1啟動子驅(qū)動的HSV-tk的選擇盒用于陰性選擇。?GFP-2A-neoR盒上游有一個由5個引物組成的同源臂，由內(nèi)含子13（950 bp），敲入插入片段（由15-24個外顯子組成）和sv40 poly（A）信號序列組成。由In14（950 bp）組成的3-prime同源臂位于GFP-2A-neoR盒的下游。為了測試體內(nèi)CAPN3表達的回補，將基因校正的iPSC衍生的成肌祖細胞移植到C3KO-NSG小鼠的心毒素預損傷脛骨前（TA）肌肉中，并回補CAPN3 mRNA。

圖4：9015 LGMD2A iPSC中CAPN3突變的基因校正。在這項研究中，研究人員采用了基于同源性的修復方法，以基于基因敲入的CAPN3突變校正（A）。通過基因組PCR擴增的LGMD2A iPSCs基因校正（C1和C10）跨區(qū)。對基因校正和未經(jīng)校正的9015 iPSC衍生的肌管以及未受影響的肌管（對照）進行RT-PCR分析。使用蛋白質(zhì)印跡法在基因校正的（C1和C10）LGMD2A iPSC衍生的肌管中拯救CAPN3蛋白表達。在驗證研究中，將患者的父母和與iPSC無關的對照a肌管作為參考（D）。另外，還通過蛋白質(zhì)印跡分析了CAPN3的自催化活性，蛋白質(zhì)獲自從在室溫下孵育0或15分鐘的肌管獲得的裂解物（E）。

CRISPR-U? 高效修飾iPSC細胞系基因

源井生物專注于iPSC重編程、基因編輯、誘導分化的優(yōu)化，已建立一套成熟的實驗流程。結(jié)合源井生物獨立創(chuàng)新的CRIPSR-U技術，打靶效率比傳統(tǒng)方法提高十倍，真正做到“實驗快人一步“！

參考文獻:

CRISPR/Cas9-based targeted genome editing for correction of recessive dystrophic epidermolysis bullosa using iPS cells. PNAS, vol. 116(52), 26846–26852, December 26, 2019.

iPSC-Derived Platelets Depleted of HLA Class I Are Inert to Anti-HLA Class I and Natural Killer Cell Immunity. Stem Cell Reports, Vol. 14, 49–59, January 14, 2020.

Gene Correction of LGMD2A Patient-Specific iPSCs for the Development of Targeted Autologous Cell Therapy. Molecular Therapy, Vol. 27 (12) December 2019.

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