創(chuàng)傷動物模型實驗-造模類型

大鼠造模：皮膚創(chuàng)面模型、皮下感染模型、皮膚損傷模型、燙傷模型、燙傷深二度模型、燒傷模型等

實驗方法及步驟：

人或動物體內(nèi)(或胚胎)的組織，將其剪碎至1mm3的組織塊，再采用如下方法進(jìn)行原代細(xì)胞分離培養(yǎng)：

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一、懸浮細(xì)胞的分離方法

1.將血液、羊水、胸水或腹水等懸液直接轉(zhuǎn)至離心管中，1000rpm/分鐘離心5分鐘。

2.去掉上清，離心沉淀用無鈣、鎂的PBS清洗后1000rpm/分鐘離心5分鐘。此步重復(fù)兩次。

3.用培養(yǎng)基重懸，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后分瓶培養(yǎng)。

4.如選用懸液中某種細(xì)胞，可采用離心后的細(xì)胞分層液獲得目的細(xì)胞。

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二、實體組織材料的分離方法

1、機(jī)械分散法

(1)纖維成分很少的腦組織，個別胚胎組織，用剪刀剪碎至1mm3的組織塊。

(2)用PBS清洗兩次后

① 用吸管吹打，分散組織細(xì)胞。

② 或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)(用九號針)，使細(xì)胞通過針頭壓出。

③ 或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物(注射器鈍端)壓擠使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。

(3)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管中，1000rpm/分鐘離心5分鐘。

(4)去上清，加入含血清的培養(yǎng)基，重懸后移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

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2、消化分離法

(1)酶消化分離法(過夜冷消化法)

① 細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等，用Hanks液清洗組織三次，剪成碎塊大小為4毫米左右。

② 再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪組織。

③ 加入0.25%的胰蛋白酶，搖勻后放4℃過夜。

④ 次日再用Hanks液洗滌，棄去上清，共洗2-3次。

⑤ 加入少量含血清的培養(yǎng)基吹打分散，細(xì)胞計數(shù)，按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。

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(2)非酶消化法(EDTA消化法)

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① 把組織塊剪碎，呈1mm3大小的組織塊。

② 將碎組織塊在平皿中用無鈣鎂PBS洗2-3次。

③ 加入消化液(胰蛋白酶或膠原酶或EDTA)于37℃水浴中作用適當(dāng)時間(中間可輕搖1~2次)，若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。

④ 棄去上清，加入含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基中止消化反應(yīng)，并洗滌2-3次后，加入完全培養(yǎng)基。

⑤ 用吸管吹打，使細(xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)過濾后分瓶培養(yǎng)。

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3、原代細(xì)胞培養(yǎng)

原代培養(yǎng)是直接從生物體獲取細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。由于細(xì)胞剛剛從活體組織分離出來，故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。這一方法可為研究生物體細(xì)胞的生長、代謝、繁殖增加有力的手段，同時也為以后傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。利用此方法還可直接服務(wù)于臨床實踐。例如，用從手術(shù)中切除的tumour細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，然后用該培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行抗ai藥物的篩選，根據(jù)zl細(xì)胞對加入的化療藥物的敏感性來幫助選擇有效的化療方案，有可能起到增強(qiáng)療效、降低副作用的作用。

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4、原代細(xì)胞的傳代、保存

(1)傳代：依椐細(xì)胞的生長狀態(tài)，生長的細(xì)胞1：2或1：3進(jìn)行傳代。

(2)保存：DMSO+培養(yǎng)液+血清

按下列順序降溫：室溫→4℃(20分鐘)→冰箱冷凍室(30分鐘)→超低溫冰箱(-80℃ 過夜)→液氮。

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5、原代細(xì)胞的復(fù)蘇

(1)取出細(xì)胞，迅速放入37℃溫水中快速解凍。

(2)吸出細(xì)胞懸液，并加10倍以上培養(yǎng)液。

(3)用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后接種培養(yǎng)瓶，放入37℃ CO2 培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

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6、個別實驗結(jié)果：

(1)成骨細(xì)胞誘導(dǎo)

(2)大鼠脂肪干細(xì)胞

(3)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

(4)人腰椎軟骨細(xì)胞原代

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