自然殺傷 (NK) 細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)中的效應(yīng)淋巴細(xì)胞，主要通過產(chǎn)生IFN-γ對(duì)抗腫瘤和入侵的病原體。IFN-γ是一種在先天性免疫和獲得性免疫中發(fā)揮著重要作用的細(xì)胞因子，參與組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)、免疫監(jiān)視和對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)?，F(xiàn)有研究認(rèn)為較高水平IFN-γ與炎癥性疾病的發(fā)生有關(guān)。例如，IFN-γ在COVID19患者中通常是上調(diào)的，并在細(xì)胞因子風(fēng)暴中起著重要作用。因此，人們認(rèn)為IFN-γ的產(chǎn)生在體內(nèi)受到嚴(yán)格的調(diào)控。近年來，研究顯示粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）可抑制NK細(xì)胞分泌IFN-γ，但其背后的機(jī)制仍不清楚。

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2022年9月13日，北京大學(xué)黃曉軍教授和李程研究員作為共同通訊作者在《Cell Reports》（IF=9.995）雜志上發(fā)表了題為《In vivo G-CSF treatment activates the GR-SOCS1 axis to suppress IFN-γ secretion by natural killer cells》的研究論文，本研究闡明了G-CSF抑制NK細(xì)胞分泌IFN-γ的潛在機(jī)制，為炎癥性疾病的干預(yù)和治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。值得注意的是，本研究中作者使用了漢恒生物提供的Crispr/Cas9慢病毒載體成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)NK92細(xì)胞中SOCS1基因的穩(wěn)定敲除。

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接下來，我們一起看下本文的主要研究結(jié)果：

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作者和其他團(tuán)隊(duì)先前的研究已報(bào)道，G-CSF可抑制骨髓和外周血中NK細(xì)胞分泌IFN-γ，而本研究作者對(duì)此做了深入探討，以揭示G-CSF抑制NK細(xì)胞分泌IFN-γ的機(jī)制。首先，對(duì)受試者連續(xù)給與G-CSF處理5天，收集處理前和處理后第4天的骨髓NK細(xì)胞，進(jìn)行RNA-seq、差異表達(dá)分析（DEA）和GO富集分析。結(jié)果顯示，相比于G-CSF處理前，G-CSF處理后的骨髓NK細(xì)胞中IFN-γ的表達(dá)水平明顯減少。這一結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)骨髓NK細(xì)胞發(fā)育、成熟和增殖的相關(guān)標(biāo)志物顯著增加，且NK細(xì)胞的凋亡受到抑制。這些結(jié)果表明G-CSF處理后改變了供體骨髓NK細(xì)胞的表型和功能。

此外，DEA結(jié)果顯示，G-CSF處理后骨髓NK細(xì)胞中SOCS1上調(diào)最為顯著。此前有研究發(fā)現(xiàn)SOCS1對(duì)小鼠體內(nèi)IFN-γ的分泌具有負(fù)調(diào)控作用[1]。[A1]?為了研究SOCS1對(duì)人源細(xì)胞IFN-γ的分泌是否也有類似的調(diào)控作用，作者構(gòu)建SOCS1過表達(dá)慢病毒載體和Crispr/Cas9慢病毒載體，分別建立了SOCS1過表達(dá)和SOCS1敲除的NK92細(xì)胞系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SOCS1能顯著減少NK92細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)；當(dāng)敲除SOCS1后，即使用G-CSF處理，IFN-γ的表達(dá)仍然會(huì)增加。上述結(jié)果表明，G-CSF處理后NK細(xì)胞分泌IFN-γ的能力減弱與SOCS1表達(dá)增加有關(guān)。

圖1? G-CSF處理導(dǎo)致IFN-γ分泌減少和SOCS1表達(dá)上調(diào)

接著，作者為了揭示G-CSF處理后SOCS1表達(dá)上調(diào)的具體機(jī)制，對(duì)之前G-CSF處理前、后的骨髓NK細(xì)胞進(jìn)行ATAC-seq檢測，結(jié)合RNA-seq的數(shù)據(jù)，使用DESeq2進(jìn)行了DEA和差異可及性分析。結(jié)果確定了147個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs）和335個(gè)差異可及區(qū)(DARs)。DEGs有上調(diào)和下調(diào)的，而所有的DARs在G-CSF處理后都表現(xiàn)出更好的染色質(zhì)可及性，且位于這些區(qū)域的大多數(shù)基因表達(dá)增加。作者將在DEGs和DARs富集的前十個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（TFs）構(gòu)建了一個(gè)TFs-基因網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)可編碼糖皮質(zhì)激素受體（GR）的NR3C1是這一網(wǎng)絡(luò)中的中心轉(zhuǎn)錄因子。而GR與糖皮質(zhì)激素（GC）結(jié)合后，GR可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中并與人類基因組的數(shù)千個(gè)位置結(jié)合。有研究報(bào)道，G-CSF介導(dǎo)的造血干細(xì)胞動(dòng)員與GC信號(hào)有關(guān)。因此，作者推測G-CSF處理激活了GC信號(hào)，進(jìn)而影響NK細(xì)胞的功能。

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，將兩組骨髓NK細(xì)胞進(jìn)行GR CUT&Tag實(shí)驗(yàn)，隨著可獲得性增加，DARs也顯示出更多的GR結(jié)合信號(hào)，表明G-CSF處理后GR被激活并影響NK細(xì)胞的基因表達(dá)。有趣的是，GR靶基因FKBP5中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前后有兩個(gè)區(qū)域的可及性增加，且正好是GR的結(jié)合位點(diǎn)，在經(jīng)G-CSF處理后顯示GR結(jié)合信號(hào)增強(qiáng)。與FKBP5類似，作者發(fā)現(xiàn)在G-CSF處理后，SOCS1[A2]?[h3]?附近的三個(gè)DARs也顯示出了GR結(jié)合信號(hào)的增加，表明SOCS1表達(dá)上調(diào)可能受GR的調(diào)控。由此證實(shí)GR可被G-CSF激活，并直接調(diào)控SOCS1的表達(dá)。

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圖2? G-CSF誘導(dǎo)染色質(zhì)整體可及性和基因表達(dá)改變

隨后，作者檢測了受試者在經(jīng)G-CSF處理前、后血漿中皮質(zhì)醇和ACTH的水平，發(fā)現(xiàn)二者的水平并沒有顯著的變化，即G-CSF處理后GR的激活與GC豐度的增加無關(guān)。而流式細(xì)胞術(shù)和RT-qPCR結(jié)果顯示，G-CSF處理顯著上調(diào)了NK92細(xì)胞和NK細(xì)胞中GR的mRNA和蛋白表達(dá)。進(jìn)一步研究表明，G-CSF處理的NK細(xì)胞中兩個(gè)參與GRs磷酸化的蛋白GSK-3b和JNK水平增加，促進(jìn)GR的Ser211和Ser226位點(diǎn)的磷酸化，從而激活GR。這些結(jié)果說明G-CSF可促進(jìn)GR轉(zhuǎn)錄，并通過磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活GR。

圖3? G-CSF激活GRs并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄

為確定GR的激活是否促進(jìn)了SOCS1的轉(zhuǎn)錄，從而抑制NK細(xì)胞中IFN-γ的分泌，作者用地塞米松和G-CSF處理NK92細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)二者均增加了NK92細(xì)胞中SOCS1的轉(zhuǎn)錄豐度，而加入GR拮抗劑RU486后顯著逆轉(zhuǎn)了二者的影響，表明GR的激活與G-CSF處理后SOCS1的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。與受試者處理相似，獲取小鼠骨髓NK細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果與人類NK細(xì)胞一致，G-CSF處理明顯增加了小鼠骨髓NK細(xì)胞中GR蛋白、NR3C1、GR靶基因的轉(zhuǎn)錄豐度；同時(shí)上調(diào)了SOCS1的表達(dá)、減少了IFN-γ的分泌，而RU486顯著逆轉(zhuǎn)了G-CSF的作用。以上結(jié)果表明，經(jīng)G-CSF處理后，GR的激活上調(diào)了NK細(xì)胞中SOCS1的表達(dá)，并抑制其產(chǎn)生IFN-γ。

圖4? GRs上調(diào)SOCS1和抑制IFN-γ的表達(dá)

接著，作者探討了GR在G-CSF處理后如何上調(diào)SOCS1的表達(dá)。采用Hi-C技術(shù)分析了人骨髓NK細(xì)胞的全基因組相互作用信息，結(jié)果顯示GC處理可增強(qiáng)G-CSF誘導(dǎo)基因的染色質(zhì)與遠(yuǎn)端區(qū)域相互作用，即G-CSF誘導(dǎo)基因的染色質(zhì)形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。此外，ATAC-seq和GR CUT&Tag分析結(jié)果顯示，G-CSF處理后，位于與G-CSF誘導(dǎo)基因相關(guān)的染色質(zhì)環(huán)中的可及性明顯增加，并且具有更強(qiáng)烈的GR結(jié)合信號(hào)。因此，說明在G-CSF處理后，增加了G-CSF誘導(dǎo)的基因與遠(yuǎn)端GR結(jié)合位點(diǎn)的相互作用。

圖5? 增強(qiáng)G-CSF誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子與遠(yuǎn)端GRs結(jié)合位點(diǎn)相互作用

最后，作者推測SOCS1的上調(diào)，與G-CSF激活GR，增強(qiáng)GR與G-CSF誘導(dǎo)基因的相互作用有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，GR可與SOCS1的第一個(gè)增強(qiáng)子（E1）結(jié)合，與第二個(gè)增強(qiáng)子（E2）有較弱的結(jié)合，此外E1結(jié)合的活化組蛋白H3K27ac水平高于E2。提示GR結(jié)合促進(jìn)了SOCS1 E1、E2和啟動(dòng)子之間的相互作用。隨后的NK細(xì)胞CTCF ChIP-seq數(shù)據(jù)表明，CTCF可與SOCS1啟動(dòng)子和E1附近的區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)E1和啟動(dòng)子的成環(huán)。用Hi-C實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)SOCS1啟動(dòng)子進(jìn)行虛擬4C分析，結(jié)果顯示，經(jīng)G-CSF處理后，SOCS1啟動(dòng)子與E1/E2之間的相互作用頻率顯著增加。上述結(jié)果表明GR與SOCS1增強(qiáng)子結(jié)合，促進(jìn)了增強(qiáng)子—啟動(dòng)子的相互作用并增加了染色質(zhì)的可及性，這可能是G-CSF處理后SOCS1表達(dá)增加的原因。

圖6? GRs促進(jìn)SOCS1基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的相互作用

綜上所述，本研究利用了整合基因組策略來揭示G-CSF抑制IFN-γ分泌的機(jī)制。作者證明了GR由G-CSF激活，并介導(dǎo)了G-CSF處理的NK細(xì)胞中基因組反應(yīng)。而活化的GR可促進(jìn)SOCS1啟動(dòng)子和增強(qiáng)子之間的相互作用，上調(diào)SOCS1的表達(dá)，從而抑制IFN-γ的分泌。這些結(jié)果在小鼠實(shí)驗(yàn)中均得到驗(yàn)證。作者揭示了NK細(xì)胞分泌IFN-γ依賴于GR/SOCS1的調(diào)節(jié)機(jī)制，為COVID-19等炎癥性疾病提供了潛在的干預(yù)和治療途徑。

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參考文獻(xiàn)：

[1] Alexander WS, Starr R, Fenner JE, Scott CL, Handman E, Sprigg NS, Corbin JE, Cornish AL, Darwiche R, Owczarek CM, Kay TW, Nicola NA, Hertzog PJ, Metcalf D, Hilton DJ. SOCS1 is a critical inhibitor of interferon gamma signaling and prevents the potentially fatal neonatal actions of this cytokine. Cell. 1999 Sep 3;98(5):597-608.