2022年1月 18?日，復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院大腸癌中心李大衛(wèi)教授與李心翔教授作為共同通訊作者，在Journal?of?Extracellular?Vesicles?(IF: 25.841)雜志發(fā)表了題為“的研究論文，報(bào)道了腫瘤衍生的細(xì)胞外囊泡(EVs)miRNA 與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的腫瘤微環(huán)境之間潛在的分子機(jī)制。復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院大腸癌中心趙森林為第一作者。文章中miRNA芯片技術(shù)及分析服務(wù)由歐易生物完成。

研究背景

結(jié)直腸癌 (CRC) 在全球癌癥相關(guān)死亡率方面排名第二，約 50% 的 CRC 死亡是由肝轉(zhuǎn)移引起的，腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境（TME）之間的相互作用在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（CRLM）中發(fā)揮著重要作用。在 CRLM 期間，癌細(xì)胞可以通過(guò)重塑 TME 來(lái)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成。據(jù)報(bào)道，活化的肝星狀細(xì)胞 (α-HSC) 特征被發(fā)現(xiàn)是繼發(fā)性或原發(fā)性肝癌中最常見(jiàn)的生物學(xué)過(guò)程，α-HSCs 可以從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)分化為高度增殖和移動(dòng)的肌成纖維細(xì)胞。此外，α-HSCs 可以通過(guò)重塑和沉積細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 來(lái)影響 CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。目前細(xì)胞外囊泡 (EVs) 以其脂質(zhì)雙層膜和攜帶許多生物分子的特點(diǎn)，通常被認(rèn)為是參與 TME 中細(xì)胞間通訊的信使，并已被證明在幾種癌癥的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。因此，探索 CRC 細(xì)胞和 HSCs 之間的相互作用，以及CRC衍生的EVs是否通過(guò)分泌富含miRNA的EVs調(diào)節(jié)HSCs以誘導(dǎo)肝轉(zhuǎn)移機(jī)制尤為重要。

研究?jī)?nèi)容

本研究通過(guò)miRNA芯片技術(shù)對(duì)高度轉(zhuǎn)移性CRC細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡RNA進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)高度轉(zhuǎn)移性CRC細(xì)胞比表現(xiàn)出低轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞釋放更多富含 miR-181a-5p 的細(xì)胞外囊泡促進(jìn)了 CRLM。此外，該研究驗(yàn)證了 FUS 介導(dǎo) miR-181a-5p 包裝入 CRC EVs，從而通過(guò)靶向 SOCS3 和激活 IL6/STAT3 信號(hào)通路來(lái)激活肝星狀細(xì)胞 (HSC)。活化的 HSC通過(guò)分泌趨化因子 CCL20，進(jìn)一步激活 CCL20/CCR6/ERK1/2/Elk-1/miR-181a-5p 正反饋回路，導(dǎo)致 TME 重塑和 CRLM 中轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成。臨床上，含有高表達(dá)miR-181a-5p 的血清 EVs 與 CRC 患者的肝轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)?？傊?，富含 miR-181a-5p 的高度轉(zhuǎn)移性 CRC 細(xì)胞衍生的 EVs 可以激活 HSC 并重塑 TME，從而促進(jìn) CRC 患者的肝轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果為CRC肝轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。

研究路線(xiàn)

研究結(jié)果

1、高轉(zhuǎn)移性 CRC 細(xì)胞的 EVs?在 CRLM 期間激活 HSC

為了探究CRC 細(xì)胞是否可以通過(guò) EVs 的活性激活肝星狀細(xì)胞，該研究中選擇了兩個(gè)具有弱轉(zhuǎn)移潛能的 CRC 細(xì)胞系和兩個(gè)具有高度轉(zhuǎn)移性的細(xì)胞系的 CRC 細(xì)胞衍生的 EVs。通過(guò)電子顯微鏡、納米粒子追蹤分析和WB進(jìn)行EVs的鑒定，并發(fā)現(xiàn)高度轉(zhuǎn)移的 CRC 細(xì)胞可以分泌出更多的 EVs（圖 1a-c）。通過(guò)免疫熒光成像發(fā)現(xiàn)CRC 細(xì)胞釋放的標(biāo)記 EVs 被遞送至 HSC（圖 1d）。

為了研究CRC來(lái)源的EVs對(duì)HSC的影響，該研究通過(guò) Transwell 分析，發(fā)現(xiàn)源自高轉(zhuǎn)移性 CRC 細(xì)胞的 EVs 可以增強(qiáng)肝星狀細(xì)胞在體外的侵襲能力（圖 1e）。

在轉(zhuǎn)移性肝癌的轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成過(guò)程中，慢性肝臟炎癥是常見(jiàn)的，所以，作者又檢測(cè)了CRC 衍生的 EVs 刺激后肝星狀細(xì)胞中促炎基因的表達(dá)水平, 發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移性 CRC 細(xì)胞的 EVs 共培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞表達(dá)的 IL-6、IL-8、COL1A1、COL3A1 和 COL4A1（尤其是 IL-6）的 mRNA 水平更高。此外，在小鼠中注射來(lái)自高轉(zhuǎn)移性 CRC 細(xì)胞的EVs 后檢測(cè)到更多的肝轉(zhuǎn)移以及重塑了肝臟 ECM（圖 1 g-j）。

圖1 | 源自高度轉(zhuǎn)移性 CRC 細(xì)胞的 EVs?介導(dǎo) HSC 的激活

2、源自富含 miR-181a-5p 的高度轉(zhuǎn)移性 CRC 細(xì)胞的 EVs?可激活 HSC

為了闡明 CRC 細(xì)胞衍生的 EVs?miRNA 是否參與 HSC 激活，作者首先使用miRNA芯片比較了來(lái)自不同 CRC 細(xì)胞的 EVs 之間的差異表達(dá)miRNA（圖 2a）。隨后，作者又使用 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行表達(dá)和預(yù)后分析，最終選擇了miR-181a-5p作為研究目標(biāo)并進(jìn)行表達(dá)量的驗(yàn)證（圖 2b）。

通過(guò)EVs?分泌抑制劑 GW4869處理和熒光標(biāo)記等實(shí)驗(yàn)，證明miR-181a-5p 通過(guò) EVs 從 CRC 細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 HSC，并且高轉(zhuǎn)移性 CRC 細(xì)胞轉(zhuǎn)移了更多的 miR-181a-5p（圖 2c-d）。

在肝星狀細(xì)胞中過(guò)表達(dá)和抑制miR-181a-5p，可以促進(jìn)或抑制肝星狀細(xì)胞的侵襲能力以及IL-6和IL-8的表達(dá)（圖 4e-f）。用miR-181a-5p模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移性 CRC 細(xì)胞，然后獲得 EVs 并將其添加到肝星狀細(xì)胞中，也可以發(fā)現(xiàn)同樣的表型（圖 2g-h）。

總之，這些結(jié)果表明CRC細(xì)胞衍生的EVs miR-181a-5p可以促進(jìn)HSC的活化。

圖2 | CRC細(xì)胞中富含miR-181a-5p的高度轉(zhuǎn)移性EVs可調(diào)節(jié)HSC的活化

3、miR-181a-5p 轉(zhuǎn)移到 EVs?受 FUS 調(diào)控

據(jù)報(bào)道，EVs 介導(dǎo)的 RNA 分泌需要特異性和選擇性的 RNA 結(jié)合蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。通過(guò)分析 RNA 結(jié)合蛋白特異性數(shù)據(jù)庫(kù)，作者通過(guò)RBPDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了miR-181a-5p的潛在的RNA結(jié)合蛋白?（RBP），并通過(guò)敲降、pull-down以及RNA 免疫沉淀等實(shí)驗(yàn)證明了FUS 可以在 CRC 細(xì)胞中介導(dǎo) miR-181a-5p 包裝到 EVs 中，并將其轉(zhuǎn)移到 HSC中（圖 3）。

圖3 | FUS 調(diào)節(jié) miR-181a-5p 轉(zhuǎn)移到高轉(zhuǎn)移性 CRC 細(xì)胞的 EVs

4、 EVs中的?miR-181a-5p 通過(guò)靶向 SOCS3 激活HSCs中的IL6/STAT3 信號(hào)通路

為了進(jìn)一步探索 CRC 細(xì)胞衍生的 EVs miR-181a-5p 在 CRLM 期間參與激活 HSCs 的機(jī)制，進(jìn)行了 GO/KEGG 富集分析（表S7，S8）。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，miR-181a-5p 序列可以比對(duì)上細(xì)胞因子信號(hào) 3 抑制因子 (SOCS3) 序列的 3'-UTR（圖 4a）。通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)、qPCR和WB實(shí)驗(yàn)證明了 SOCS3 是miR-181a-5p的靶基因（圖 4b-d）。通過(guò)挽救實(shí)驗(yàn)證明了miRNA可以通過(guò)抑制靶基因來(lái)發(fā)揮促進(jìn)侵襲和激活I(lǐng)L6/STAT3 信號(hào)通路的功能（圖 4f-h）。同時(shí)，使用過(guò)表達(dá)或抑制miR-181a-5p的EVs處理靶細(xì)胞，也有相同的表型（圖4e、4j-k）。

這些數(shù)據(jù)表明，EVs miR-181a-5p 通過(guò)激活 IL6/STAT3 信號(hào)通路靶向 SOCS3 直接激活 HSC。

圖4 | 源自高轉(zhuǎn)移性 CRC 細(xì)胞的富含miR-181a- 5 p 的 EVs?通過(guò) IL6/STAT3 信號(hào)通路靶向 SOCS3 激活 HSC

5、由CRC 衍生的 EVs?miR-181a-5p 激活的HSC 反過(guò)來(lái)促進(jìn) CRLM

通過(guò)體外 Transwell 測(cè)定，證明外源性 miR-181a-5p 可以顯著促進(jìn) CRC 細(xì)胞的遷移和侵襲（圖 5a-b）。此外，體外 Transwell 測(cè)定（圖 5c-d）和體內(nèi)肝轉(zhuǎn)移小鼠模型（圖 5e-g) 都表明，由 CRC 細(xì)胞衍生的 EVs miR-181a-5p 激活的 α-HSCs 反過(guò)來(lái)也促進(jìn)了 CRC 細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移性腫瘤集落在肝臟中的形成。隨后，使用 WB 分析和 IHC 染色進(jìn)一步檢查了小鼠肝臟轉(zhuǎn)移灶中 ECM 成分的表達(dá)，結(jié)果表明CRC細(xì)胞衍生的EVs miR-181a-5p通過(guò)增加α-SMA和纖連蛋白的表達(dá)，同時(shí)降低玻連蛋白和生腱蛋白C的表達(dá)，重塑了肝臟ECM（圖 5h）。因此，這些表明 CRC 細(xì)胞衍生的 EVs miR-181a-5p 可以重塑 CRLM 期間的轉(zhuǎn)移前生態(tài)位。

圖5 | 由CRC 細(xì)胞衍生的富含miR-181a-5p的 EVs?激活的 HSC促進(jìn)體外CRC細(xì)胞遷移和侵襲以及體內(nèi)肝轉(zhuǎn)移

6、活化的HSCs通過(guò)激活CRC中的CCL20/CCR6軸來(lái)促進(jìn)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移

由于α-HSC可能分泌包括趨化因子在內(nèi)的促炎信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)TME和癌癥進(jìn)展，所以研究者通過(guò)人類(lèi)趨化因子篩選檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)了與 RKO 細(xì)胞衍生的 EVs 或陰性對(duì)照預(yù)培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞中的趨化因子水平，并通過(guò)定量和挽救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CCL20是受miR-181a-5p調(diào)節(jié)最明顯的趨化因子（圖 6a-c）。此外，CCL20的受體 CCR6 蛋白在CRC 組織中的表達(dá)也明顯強(qiáng)于正常組織（圖 6d），表明 LX2細(xì)胞分泌的CCL20可能對(duì)CRC細(xì)胞發(fā)揮作用。

為了進(jìn)一步研究CCL20/CCR6軸在CRLM中的作用，用抗體中和和敲降兩種方式來(lái)抑制CCL20/CCR6軸可以部分抵消α-HSC在體外和體內(nèi)對(duì)CRC細(xì)胞遷移、侵襲和肝轉(zhuǎn)移的增強(qiáng)作用（圖6e-i）。以上結(jié)果表明，CRC細(xì)胞衍生的EVs miR-181a-5p可以激活HSC，而 α-HSC又通過(guò)激活CRC中的CCL20/CCR6軸來(lái)促進(jìn)CRLM。

圖6 | 活化的 HSC 通過(guò) CCL20/CCR6 軸促進(jìn) CRC 肝轉(zhuǎn)移

7、CCL20/CCR6/ERK1/2/Elk-1/miR-181a-5p正反饋回路在CRLM期間介導(dǎo)HSC和CRC細(xì)胞之間的相互作用

該研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miRNA的肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)基處理腫瘤細(xì)胞是可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞中的miRNA表達(dá)的，如果用CCL20的抗體中和處理HSC細(xì)胞后，這個(gè)現(xiàn)象會(huì)消失，就說(shuō)明了α-HSCs可以通過(guò)CCL20來(lái)影響CRC細(xì)胞的功能，并且腫瘤細(xì)胞中的miR-181a-5p表達(dá)也會(huì)受到CCL20和ERK1/2 信號(hào)通路的正向調(diào)節(jié)（圖 7a-b）。

由于ERK1/2 易位到細(xì)胞核并促進(jìn)其靶基因的轉(zhuǎn)錄，因此作者通過(guò)敲降、熒光素酶報(bào)告和位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)、挽救實(shí)驗(yàn)等一系列分子實(shí)驗(yàn)，證明了HSC通過(guò)分泌的CCL20來(lái)促進(jìn)ERK1/2信號(hào)通路的激活，激活的ERK1/2信號(hào)通路進(jìn)一步通過(guò)Elk-1促進(jìn)了CRC中的miRNA表達(dá)，形成了一個(gè)正反饋調(diào)控回路（圖 7c-j）。

圖7 | CCL20/CCR6/ERK1/2/Elk-1/miR-181a-5p正反饋回路在CRLM期間介導(dǎo)HSC和CRC細(xì)胞之間的相互作用

8、miR-181a-5p 可作為 CRLM 的新型生物標(biāo)志物

最后，為了進(jìn)一步證實(shí) CRLM 中 miR-181a-5p 表達(dá)的臨床意義，作者對(duì)結(jié)直腸癌組織、患者血清外泌體中的miR-181a-5p表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)III-IV期腫瘤中miR-181a-5p的表達(dá)顯著高于I-II期的腫瘤組織（圖8a），肝轉(zhuǎn)移患者血清EVs中miR-181a-5p的表達(dá)水平高于無(wú)轉(zhuǎn)移的患者（圖8b）。此外，miR-181a-5p表達(dá)較高的CRLM患者也表現(xiàn)出更高的CEA和α-SMA表達(dá)（圖 8e）。CRLM 患者腫瘤組織中miR-181a-5p高表達(dá)，預(yù)示著預(yù)后較差（圖 8f-g )。綜上所述，這些結(jié)果表明CRC衍生的EVs miR-181a-5p在CRC的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，尤其是在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中。

圖8 | EVs?miR-181a-5p 可作為 CRC 肝轉(zhuǎn)移患者的新型生物標(biāo)志物

研究結(jié)論

1）?高度轉(zhuǎn)移性 CRC 衍生的 EVs miR-181a-5p 通過(guò)調(diào)節(jié) IL6/STAT3 信號(hào)通路激活 HSC；

2）?通過(guò) ERK/Elk-1 通路上調(diào) CRC 中 miR-181a-5p 的表達(dá)，在 CRC 細(xì)胞和 HSC 之間形成正反饋回路，使得TME 重編程，最終導(dǎo)致 CRLM中轉(zhuǎn)移前小生境的形成。

參考文獻(xiàn)：

Zhao, S., Mi, Y., Zheng, B., Wei, P., Gu, Y., Zhang, Z., Xu, Y., Cai, S., Li, X., & Li, D. (2022). Highly-metastatic colorectal cancer cell released miR-181a-5p-rich extracellular vesicles promote liver metastasis by activating hepatic stellate cells and remodeling the tumor microenvironment. Journal of Extracellular Vesicles, 11, e12186. https://doi.org/10.1002/jEVs2.12186\

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