以下文章來(lái)源于園藝研究?，作者吳昕揚(yáng)

園藝研究.

《園藝研究》（Horticulture Research）是南京農(nóng)業(yè)大學(xué)主辦的英文學(xué)術(shù)期刊，采用開(kāi)放獲取形式，專注刊載和園藝作物有關(guān)，能引起廣泛的國(guó)際和學(xué)科興趣的基礎(chǔ)和理論研究。

豆類作物是世界第二大作物，豆類蔬菜則是我國(guó)和東亞、東南亞國(guó)家重要的蔬菜門(mén)類。菜豆（別稱四季豆、架豆、油豆角等）、菜用大豆（毛豆）、豇豆、豌豆、扁豆等是種植最廣泛的豆類蔬菜，但目前除大豆外，其他豆類蔬菜的遺傳轉(zhuǎn)化還較為困難，嚴(yán)重制約了其功能基因組學(xué)研究。

2023年4月，Horticulture Research上線了（Advance Access）中國(guó)計(jì)量大學(xué)徐沛課題組題為A molecular toolkit to boost functional genomic studies in transformation-recalcitrant vegetable legumes?的論文。

本研究開(kāi)發(fā)了并展示了一個(gè)針對(duì)難以進(jìn)行穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化的豆類蔬菜（菜豆、豌豆、豇豆）的高效易用的分子工具包，用于在不依賴穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因的情況下開(kāi)展基因功能研究，具體包括了以下技術(shù)體系：

葉片原位瞬時(shí)基因過(guò)表達(dá)系統(tǒng)。基于農(nóng)桿菌真空浸潤(rùn)在活體上進(jìn)行瞬時(shí)過(guò)表達(dá)。利用該手段在菜豆、豇豆、豌豆等豆類蔬菜中進(jìn)行了蛋白亞細(xì)胞定位和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)，證明在本物種中的表達(dá)優(yōu)于煙草異源表達(dá)系統(tǒng)。同時(shí)，應(yīng)用該系統(tǒng)對(duì)菜豆重金屬響應(yīng)基因PvXTH23進(jìn)行了抗逆功能驗(yàn)證，進(jìn)一步證明了其實(shí)用性。

基于農(nóng)桿菌的原位瞬時(shí)RNA干擾系統(tǒng)。通過(guò)構(gòu)建并表達(dá)帶有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的載體，對(duì)內(nèi)源基因進(jìn)行RNA干擾。選擇了ABA途徑中的關(guān)鍵基因ABA3進(jìn)行測(cè)試，該基因被報(bào)道參與ABA的生物合成和氣孔的開(kāi)合。分別在菜豆、豌豆、豇豆中將ABA3進(jìn)行瞬時(shí)沉默，沉默效率最高可達(dá)74%。同時(shí)檢測(cè)到ABA3沉默后ABA途徑下游基因的表達(dá)下調(diào)并伴隨著氣孔的開(kāi)放，證明了該系統(tǒng)在豆類蔬菜基因功能研究中的可靠性。

基于煙草脆裂病毒（TRV）的基因長(zhǎng)時(shí)過(guò)表達(dá)系統(tǒng)。通過(guò)克隆已知的廣譜抗性基因PvPR1，連接TRV-RNA2，構(gòu)建了其TRV表達(dá)載體，并浸潤(rùn)菜豆葉片。農(nóng)桿菌浸潤(rùn)7天可觀察到目標(biāo)蛋白的熒光信號(hào)，且能夠至少持續(xù)至15天后，也能觀察到其抗病的表型。同時(shí)也在其他豆類蔬菜上上觀察到了類似的結(jié)果。該技術(shù)適合于需要基因長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)的研究場(chǎng)景。

多靶點(diǎn)基因編輯系統(tǒng)。目前尚無(wú)CRISPR / Cas介導(dǎo)的基因編輯在菜豆中應(yīng)用的報(bào)道。作者利用大豆中開(kāi)發(fā)的pGmUbi-Cas9-4XsgR載體，在菜豆中建立了多靶點(diǎn)基因編輯系統(tǒng)。設(shè)計(jì)了靶向PvPDS基因的四個(gè)sgRNA，構(gòu)建多重敲除載體，并進(jìn)行發(fā)根農(nóng)桿菌侵染。對(duì)發(fā)狀根的測(cè)序結(jié)果顯示，基因編輯效率達(dá)到68.75%，證明了該系統(tǒng)在菜豆中的有效性和在豆科作物中進(jìn)行基因操作的巨大潛力。

綜上所述，作者開(kāi)發(fā)了一個(gè)高效且易于操作的分子工具包，可以在很大程度上打破豆類蔬菜基因功能研究的瓶頸。

中國(guó)計(jì)量大學(xué)生科院植物表型計(jì)量與質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室青年教師吳昕揚(yáng)博士為本論文第一作者，張培培博士（現(xiàn)單位：之江實(shí)驗(yàn)室）為本文做出重要貢獻(xiàn)，徐沛研究員為論文通訊作者。該研究獲得了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022YFE0198000）、國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（32202470、32202521）、省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金（2021DC700024-KF202217）以及浙江省自然科學(xué)基金（LQ21C150004）資助。同時(shí)，感謝南京農(nóng)業(yè)大學(xué)喻德躍教授饋贈(zèng)多重基因編輯載體。

作者團(tuán)隊(duì)介紹

徐沛課題組長(zhǎng)期從事園藝作物生理表型組學(xué)和豆類蔬菜遺傳改良研究，在農(nóng)工信學(xué)科交叉融合方面形成了一定特色。近2年研發(fā)了高通量表型—基因型聯(lián)合解析系列新方法和具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型高通量植物柔性傳感器系統(tǒng)，部分研究成果已發(fā)表在Plant J、iScience、J?Hazard Mater、JAFC、Hortic?Res等雜志。

文章鏈接：

https://doi.org/10.1093/hr/uhad064

——點(diǎn)擊閱讀推薦文章——

Understanding water conservation vs. profligation traits?in vegetable legumes through a?physio-transcriptomic-functional approach?

https://doi.org/10.1093/hr/uha?c287

Hortic Res | 中國(guó)計(jì)量大學(xué)徐沛組利用生理表型組聯(lián)合功能分析手段闡釋豆類蔬菜水分利用差異機(jī)理

Telomere-to-telomere and gap-free reference genome assembly of the kiwifruit?Actinidia chinensis

https://doi.org/10.1093/hr/uhac264

Hortic Res | 獼猴桃T2T參考基因組