沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過(guò)程。沉淀法（即溶解度法）操作簡(jiǎn)便，成本低廉，不僅用于實(shí)驗(yàn)室中，也用于某些生產(chǎn)目的的制備過(guò)程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時(shí)最常用的方法。通過(guò)沉淀，將目的生物大分子轉(zhuǎn)入固相沉淀或留在液相，而與雜質(zhì)得到初步的分離。

? 此方法的基本原理是根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的溶解度不同而達(dá)到分離的目的，不同溶解度的產(chǎn)生是由于溶質(zhì)分子之間及溶質(zhì)與溶劑分子之間親和力的差異而引起的，溶解度的大小與溶質(zhì)和溶劑的化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)有關(guān)，溶劑組分的改變或加入某些沉淀劑以及改變?nèi)芤旱膒H值、離子強(qiáng)度和極性都會(huì)使溶質(zhì)的溶解度產(chǎn)生明顯的改變。

? 在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法是：

? ⑴中性鹽沉淀（鹽析法）：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。

? ⑵有機(jī)溶劑沉淀：多用于蛋白質(zhì)和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分離純化。

? ⑶選擇性沉淀（熱變性沉淀和酸堿變性沉淀）：多用于除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。

? ⑷等電點(diǎn)沉淀：用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其他兩性物質(zhì)的沉淀，但此法單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其他方法結(jié)合使用。

? ⑸有機(jī)聚合物沉淀： 是發(fā)展較快的一種新方法， 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作為沉淀劑。

1 中性鹽沉淀（鹽析法）

? 在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過(guò)程稱為“鹽析”。除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進(jìn)行沉淀分離，20％～40％飽和度的硫酸銨可以使許多病毒沉淀，43％飽和度的硫酸銨可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保留在上清。鹽析法應(yīng)用最廣的還是在蛋白質(zhì)領(lǐng)域，已有八十多年的歷史，其突出的優(yōu)點(diǎn)是：①成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。②操作簡(jiǎn)單、安全。③對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。

? ⑴ 中性鹽沉淀蛋白質(zhì)的基本原理

? 蛋白質(zhì)和酶均易溶于水，因?yàn)樵摲肿拥模瑿OOH、－NH2和－OH都是親水基團(tuán)，這些基團(tuán)與極性水分子相互作用形成水化層，包圍于蛋白質(zhì)分子周圍形成1nm～100nm顆粒的親水膠體，削弱了蛋白質(zhì)分子之間的作用力，蛋白質(zhì)分子表面極性基團(tuán)越多，水化層越厚，蛋白質(zhì)分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解度也越大。親水膠體在水中的穩(wěn)定因素有兩個(gè)：即電荷和水膜。因?yàn)橹行喳}的親水性大于蛋白質(zhì)和酶分子的親水性，所以加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區(qū)域，同時(shí)又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀。鹽析示意圖如下頁(yè)“圖2－1”所示。

? ⑵ 中性鹽的選擇

? 常用的中性鹽中最重要的是（NH4）2SO4，因?yàn)樗c其他常用鹽類相比有十分突出的優(yōu)點(diǎn)：

? ?① 溶解度大：尤其是在低溫時(shí)仍有相當(dāng)高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下（0～4℃）進(jìn)行。由下表可以看到，（NH4）2SO4在0℃時(shí)仍有70.6％的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類：

? ? ? 表1 幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水）? ? ? ? ? ?

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??0℃? ? 20℃? ? ?80℃? ? 100 ℃? ??

? ? （NH4）2SO4? ?70.6? ? 75.4? ? ?95.3? ? ?103

? ? ?Na2SO4? ? ? ? ? ? 4.9? ? ?18.9? ? ?43.3? ? ?42.2

? ? ?NaH2PO4? ? ? ? ??1.6? ? ?7.8? ? ? 93.8? ? ?101

? ?② 分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去75％的雜蛋白，純度提高了四倍。

? ?③ 不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有的酶或蛋白質(zhì)用2～3mol/L的（NH4）2SO4保存可達(dá)數(shù)年之久。

? ?④ 價(jià)格便宜，廢液不污染環(huán)境。

? ⑶ 鹽析的操作方法

? 最常用的是固體硫酸銨加入法。欲從較大體積的粗提取液中沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，往往使用固體硫酸銨，加入之前要先將其研成細(xì)粉不能有塊，要在攪拌下緩慢均勻少量多次地加入，尤其到接近計(jì)劃飽和度時(shí)，加鹽的速度更要慢一些，盡量避免局部硫酸銨濃度過(guò)大而造成不應(yīng)有的蛋白質(zhì)沉淀。鹽析后要在冰浴中放置一段時(shí)間，待沉淀完全后再離心與過(guò)濾。在低濃度硫酸銨中鹽析可采用離心分離，高濃度硫酸銨常用過(guò)濾方法，因?yàn)楦邼舛攘蛩徜@密度太大，要使蛋白質(zhì)完全沉降下來(lái)需要較高的離心速度和較長(zhǎng)的離心時(shí)間。

? 各種飽和度下需加固體硫酸銨的量可由附錄中查出。硫酸銨濃度的表示方法是以飽和溶液的百分?jǐn)?shù)表示，稱為百分飽和度，而不用實(shí)際的克數(shù)或克分子數(shù)，這是由于當(dāng)固體硫酸銨加到水溶液中去時(shí)，會(huì)出現(xiàn)相當(dāng)大的非線性體積變化，計(jì)算濃度相當(dāng)麻煩，為了克服這一困難，有人經(jīng)過(guò)精心測(cè)量，確定出1升純水提高到不同濃度所需加入硫酸銨的量，附錄中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以飽和濃度的百分?jǐn)?shù)表示，使用時(shí)十分方便。

? ⑷ 鹽析曲線的制作?

? 如果要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，沒(méi)有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可以借鑒，則應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度。具體操作方法如下：

? 取已定量測(cè)定蛋白質(zhì)或酶的活性與濃度的待分離樣品溶液，冷至0℃～5℃，調(diào)至該蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH值，分6～10次分別加入不同量的硫酸銨，第一次加硫酸銨至蛋白質(zhì)溶液剛開(kāi)始出現(xiàn)沉淀時(shí)，記下所加硫酸銨的量，這是鹽析曲線的起點(diǎn)。繼續(xù)加硫酸銨至溶液微微混濁時(shí)，靜止一段時(shí)間，離心得到第一個(gè)沉淀級(jí)分，然后取上清再加至混濁，離心得到第二個(gè)級(jí)分，如此連續(xù)可得到6～10個(gè)級(jí)分，按照每次加入硫酸銨的量，在附錄中查出相應(yīng)的硫酸銨飽和度。將每一級(jí)分沉淀物分別溶解在一定體積的適宜的pH緩沖液中，測(cè)定其蛋白質(zhì)含量和酶活力。以每個(gè)級(jí)分的蛋白質(zhì)含量和酶活力對(duì)硫酸銨飽和度作圖，即可得到鹽析曲線。

? ⑸鹽析的影響因素

① 蛋白質(zhì)的濃度：中性鹽沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，溶液中蛋白質(zhì)的實(shí)際濃度對(duì)分離的效果有較大的影響。通常高濃度的蛋白質(zhì)用稍低的硫酸銨飽和度即可將其沉淀下來(lái)，但若蛋白質(zhì)濃度過(guò)高，則易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用，除雜蛋白的效果會(huì)明顯下降。對(duì)低濃度的蛋白質(zhì)，要使用更大的硫酸銨飽和度，但共沉淀作用小，分離純化效果較好，但回收率會(huì)降低。通常認(rèn)為比較適中的蛋白質(zhì)濃度是2.5％～3.0％，相當(dāng)于25 mg/mL～30mg/mL。

② pH值對(duì)鹽析的影響：蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，它的溶解度就越大。改變pH值可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，因而就改變了蛋白質(zhì)的溶解度。遠(yuǎn)離等電點(diǎn)處溶解度大，在等電點(diǎn)處溶解度小，因此用中性鹽沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。

③ 溫度的影響：溫度是影響溶解度的重要因素，對(duì)于多數(shù)無(wú)機(jī)鹽和小分子有機(jī)物，溫度升高溶解度加大，但對(duì)于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，在高離子強(qiáng)度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強(qiáng)度溶液或純水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還是隨濃度升高而增加的。在一般情況下，對(duì)蛋白質(zhì)鹽析的溫度要求不嚴(yán)格，可在室溫下進(jìn)行。但對(duì)于某些對(duì)溫度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力喪失。?

?2有機(jī)溶劑沉淀法

? ⑴基本原理

? 有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。其沉淀作用的原理主要是降低水溶液的介電常數(shù)，溶劑的極性與其介電常數(shù)密切相關(guān)，極性越大，介電常數(shù)越大，如20℃時(shí)水的介電常數(shù)為80，而乙醇和丙酮的介電常數(shù)分別是24和21.4，因而向溶液中加入有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，增加了蛋白質(zhì)分子間的相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。溶液介電常數(shù)的減少就意味著溶質(zhì)分子異性電荷庫(kù)侖引力的增加，使帶電溶質(zhì)分子更易互相吸引而凝集，從而發(fā)生沉淀。另一方面，由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶，它們?cè)谌芙庥谒耐瑫r(shí)從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。

? 有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是：①分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。②沉淀不用脫鹽，過(guò)濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機(jī)溶劑）。因而在生化制備中有廣泛的應(yīng)用。其缺點(diǎn)是對(duì)某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進(jìn)行。

? ⑵有機(jī)溶劑的選擇和濃度的計(jì)算

? 用于生化制備的有機(jī)溶劑的選擇首先是要能與水互溶。沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀劑是乙醇。

? 進(jìn)行沉淀操作時(shí)，欲使溶液達(dá)到一定的有機(jī)溶劑濃度，需要加入的有機(jī)溶劑的濃度和體積可按下式計(jì)算：

? ? ? ? ? V = V0 (S2 －S1) ／(100－S2)

式中：

? ?V = 需加入100％濃度有機(jī)溶劑的體積

? ?V0 = 原溶液體積

? ?S1 = 原溶液中有機(jī)溶劑的濃度

? ?S2 = 所要求達(dá)到的有機(jī)溶劑的濃度

? 100是指加入的有機(jī)溶劑濃度為100％，如所加入的有機(jī)溶劑的濃度為95％，上式的(100－S2) 項(xiàng)應(yīng)改為 (95－S2) 。

? 上式的計(jì)算由于未考慮混溶后體積的變化和溶劑的揮發(fā)情況，實(shí)際上存在一定的誤差。有時(shí)為了獲得沉淀而不著重于進(jìn)行分離，可用溶液體積的倍數(shù)：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機(jī)溶劑，來(lái)進(jìn)行有機(jī)溶劑沉淀。

? ⑶有機(jī)溶劑沉淀的影響因素

? ?① 溫度： 多數(shù)蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑與水的混合液中，溶解度隨溫度降低而下降。值得注意的是大多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機(jī)溶劑中對(duì)溫度特別敏感，溫度稍高就會(huì)引起變性，且有機(jī)溶劑與水混合時(shí)產(chǎn)生放熱反應(yīng)，因此有機(jī)溶劑必須預(yù)先冷至較低溫度，操作要在冰鹽浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑時(shí)必須緩慢且不斷攪拌以免局部過(guò)濃。一般規(guī)律是溫度越低，得到的蛋白質(zhì)活性越高。??

? ?②樣品濃度：樣品濃度對(duì)有機(jī)溶劑沉淀生物大分子的影響與鹽析的情況相似：低濃度樣品要使用比例更大的有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀，且樣品的損失較大，即回收率低，具有生物活性的樣品易產(chǎn)生稀釋變性。但對(duì)于低濃度的樣品，雜蛋白與樣品共沉淀的作用小，有利于提高分離效果。反之，對(duì)于高濃度的樣品，可以節(jié)省有機(jī)溶劑，減少變性的危險(xiǎn)，但雜蛋白的共沉淀作用大，分離效果下降。通常，使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白質(zhì)初濃度為宜，可以得到較好的沉淀分離效果。??

? ?③ pH值：有機(jī)溶劑沉淀適宜的pH值，要選擇在樣品穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi)，而且盡可能選擇樣品溶解度最低的pH值，通常是選在等電點(diǎn)附近，從而提高此沉淀法的分辨能力。

? ?④ 離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度是影響有機(jī)溶劑沉淀生物大分子的重要因素。以蛋白質(zhì)為例，鹽濃度太大或太小都有不利影響，通常溶液中鹽濃度以不超過(guò)5％為宜，使用乙醇的量也以不超過(guò)原蛋白質(zhì)水溶液的２倍體積為宜，少量的中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)變性有良好的保護(hù)作用，但鹽濃度過(guò)高會(huì)增加蛋白質(zhì)在水中的溶解度，降低了有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)的效果，通常是在低鹽或低濃度緩沖液中沉淀蛋白質(zhì)。

? 有機(jī)溶劑沉淀法經(jīng)常用于蛋白質(zhì)、酶、多糖和核酸等生物大分子的沉淀分離，使用時(shí)先要選擇合適的有機(jī)溶劑，然后注意調(diào)整樣品的濃度、溫度、pH值和離子強(qiáng)度，使之達(dá)到最佳的分離效果。沉淀所得的固體樣品，如果不是立即溶解進(jìn)行下一步的分離，則應(yīng)盡可能抽干沉淀，減少其中有機(jī)溶劑的含量，如若必要可以裝透析袋透析脫有機(jī)溶劑，以免影響樣品的生物活性。

3 選擇性變性沉淀法

? 這一方法是利用蛋白質(zhì)、酶與核酸等生物大分子與非目的生物大分子在物理化學(xué)性質(zhì)等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分離提純，稱為選擇性變性沉淀法。常用的有熱變性、選擇性酸堿變性和有機(jī)溶劑變性等。

? ⑴ 熱變性

? 利用生物大分子對(duì)熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使某些非目的生物大分子變性沉淀而保留目的物在溶液中。此方法最為簡(jiǎn)便，不需消耗任何試劑，但分離效率較低，通常用于生物大分子的初期分離純化。

? ⑵ 表面活性劑和有機(jī)溶劑變性

? 不同蛋白質(zhì)和酶等對(duì)于表面活性劑和有機(jī)溶劑的敏感性不同，在分離純化過(guò)程中使用它們可以使那些敏感性強(qiáng)的雜蛋白變性沉淀，而目的物仍留在溶液中。使用此法時(shí)通常都在冰浴或冷室中進(jìn)行，以保護(hù)目的物的生物活性。

? ⑶ 選擇性酸堿變性

? 利用蛋白質(zhì)和酶等對(duì)于溶液中酸堿不同pH值的穩(wěn)定性不同而使雜蛋白變性沉淀，通常是在分離純化流程中附帶進(jìn)行的一個(gè)分離純化步驟。

4 等電點(diǎn)沉淀法

? 等電點(diǎn)沉淀法是利用具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，在達(dá)到電中性時(shí)溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實(shí)現(xiàn)分離的方法。氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì)，可以利用此法進(jìn)行初步的沉淀分離。但是，由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨(dú)使用此法分辨率較低，效果不理想，因而此法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物。

5 有機(jī)聚合物沉淀法

? 有機(jī)聚合物是六十年代發(fā)展起來(lái)的一類重要的沉淀劑，最早應(yīng)用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細(xì)菌和病毒。近年來(lái)廣泛用于核酸和酶的純化。其中應(yīng)用最多的是聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n ＞4)( Polyethylene Glycol 簡(jiǎn)寫為 PEG )，它的親水性強(qiáng)，溶干水和許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為6000～20000的 PEG。

? PEG的沉淀效果主要與其本身的濃度和分子量有關(guān)，同時(shí)還受離子強(qiáng)度、溶液pH和溫度等因素的影響。在一定的pH值下，鹽濃度越高，所需PEG時(shí)濃度越低，溶液的pH越接近目的物的等電點(diǎn)，沉淀所需PEG的濃度越低。在一定范圍內(nèi)，高分子量和濃度高的PEG沉淀的效率高。以上這些現(xiàn)象的理論解釋還都僅僅是假設(shè)，未得到充分的證實(shí)，其解釋主要有：①認(rèn)為沉淀作用是聚合物與生物大分子發(fā)生共沉淀作用。②由于聚合物有較強(qiáng)的親水性，使生物大分子脫水而發(fā)生沉淀。③聚合物與生物大分子之間以氫鍵相互作用形成復(fù)合物，在重力作用下形成沉淀析出。④通過(guò)空間位置排斥，使液體中生物大分子被迫擠聚在一起而發(fā)生沉淀。

? 本方法的優(yōu)點(diǎn)是：①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。②沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相當(dāng)多的生物大分子。③沉淀后有機(jī)聚合物容易去除。