歐易生物單細胞測序近期高分文章不斷，在接下來的幾篇單細胞文獻解讀軟文里，我們將為大家持續(xù)送上近期合作發(fā)表的單細胞文獻解讀。本篇文章為大家解讀今年5月由上海交通大學(xué)附屬上海市第一人民醫(yī)院劉堃團隊在Diabetes (IF 9.461) 期刊發(fā)表的關(guān)于2型糖尿病小鼠視網(wǎng)膜組織的分子圖譜和異質(zhì)性的相關(guān)成果。

?基本信息?

材料：3只2型糖尿病模型小鼠 (db/db)；3只對照小鼠 (db/m) 的視網(wǎng)膜組織

期刊：Diabetes

發(fā)表時間：2021年5月

方法：歐易生物10x Genomics scRNA-seq

研究背景和研究目的

糖尿病視網(wǎng)膜病變 (DR) 是導(dǎo)致中年人獲得性失明的主要原因，而現(xiàn)有的治療只針對伴有視力損害的晚期DR，因此迫切需要預(yù)防和早期治療方針。鑒于視網(wǎng)膜錯綜復(fù)雜的細胞結(jié)構(gòu)，DR的復(fù)雜病理很難解剖。本研究期望通過單細胞測序 (scRNA-seq) 技術(shù)全面解析DR視網(wǎng)膜組織分子圖譜特征，闡明介導(dǎo)DR發(fā)病的主要因素。

研究內(nèi)容概述

對3只對照小鼠 (db/ m) 和3只2型糖尿病模型小鼠 (db/db)?的視網(wǎng)膜組織進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，分別獲得34,010和51,558個視網(wǎng)膜細胞用于后續(xù)分析，共鑒定為11種細胞類型。隨后，通過基于全基因組關(guān)聯(lián)研究 (GWAS) 的富集分析和差異分析確定了幾個可能在疾病過程中作用更大的細胞群。此外，作者還系統(tǒng)地描繪了糖尿病和對照小鼠的視網(wǎng)膜細胞間通訊網(wǎng)絡(luò)。作者分析了db/db和db/m小鼠各細胞類型間的差異基因，并推測RLBP1基因可以作為DR的治療靶點，隨后利用實驗驗證了其在穆勒神經(jīng)膠質(zhì)細胞中過表達能夠緩解DR相關(guān)的神經(jīng)血管變性。

具體研究內(nèi)容解析

1.?視網(wǎng)膜細胞類型的鑒定

Figure 1. 視網(wǎng)膜細胞群和易受DR影響的視網(wǎng)膜細胞的測定

首先對樣本細胞經(jīng)過質(zhì)控后，分別獲得對照組/糖尿病小鼠的34,010/51,558個視網(wǎng)膜細胞用于后續(xù)分析?；谝延械膍arker基因，作者共將17個cluster鑒定為11個細胞類型 (Figure 1A-1C)，包括視桿細胞、視錐雙極細胞、視桿雙極細胞、穆勒神經(jīng)膠質(zhì)細胞、無長突細胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞、視錐細胞、小膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞、周細胞和水平細胞。此外，作者比較了糖尿病小鼠和對照組小鼠視網(wǎng)膜中各細胞群細胞數(shù)的占比情況 (Figure 1D)，該分析有助于篩選出易受DR影響的細胞類型。

2.?DR相關(guān)風(fēng)險位點的細胞類型的特異性表達

Figure 2.?DR和PDR (增殖性DR) 相關(guān)風(fēng)險位點的細胞類型特異性表達

為了揭示已鑒定的細胞群與DR和PDR之間的潛在聯(lián)系，作者利用GWAS分析獲得與DR和PDR相關(guān)的風(fēng)險位點，并在db/m和db/db小鼠視網(wǎng)膜細胞群中分析其差異表達水平 (Figure 2A-B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)視桿細胞、視桿雙極細胞、視錐細胞和血管內(nèi)皮細胞與PDR風(fēng)險關(guān)系最密切。此外，在穆勒神經(jīng)膠質(zhì)細胞中，cluster6細胞群與db/ m和db/db小鼠之間視網(wǎng)膜的變化關(guān)系更密切，表明它們可能在疾病過程中發(fā)揮更大的作用。

3.?DR改變了視網(wǎng)膜細胞間的通訊

Figure?3. db/m和db/db小鼠視網(wǎng)膜細胞間通訊的改變

基于受體配體分析，作者分別構(gòu)建了db/m和db/db小鼠的視網(wǎng)膜細胞間的通訊網(wǎng)絡(luò) (Figure 3A)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組樣本的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞、血管內(nèi)皮細胞和穆勒神經(jīng)膠質(zhì)細胞的受體配體表達活性最高。此外，與db/m小鼠相比，db/db小鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞的受體配體表達活性增高，而其他細胞類型表達活性降低。

此外，在db/m和db/db小鼠之間，特異性受體配體的相互作用也發(fā)生了改變。作者假設(shè)細胞類型比例的變化可以通過參與細胞間相互作用的基因的變化來解釋。為了驗證這一點，作者檢測了每個受體配體對所在的細胞亞群：配體在一個細胞亞群中的表達水平是否與表達其受體的細胞亞群的比例相關(guān)（包括自分泌通訊）。例如，糖尿病期間視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞、視桿細胞和視錐細胞上調(diào)VEGFA與穆勒神經(jīng)膠質(zhì)細胞比例的下降相關(guān)，穆勒神經(jīng)膠質(zhì)細胞表達其受體VEGFR2，該受體由kdr編碼 (Figure 3B)。此外，表達ephb1的穆勒神經(jīng)膠質(zhì)細胞的比例與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞表達的efnb3相關(guān) (Figure 3B)。

4.?DR致病性相關(guān)基因的鑒定

Figure 4. DR相關(guān)基因鑒定

與一般轉(zhuǎn)錄組測序相比，作者使用scRNA-seq進行基因表達分析，希望通過各細胞類型的基因組信息闡明可能隱藏在整體組織分析中的DR病理機制。為了識別可能導(dǎo)致DR發(fā)病的特異性基因，作者檢測了每一種細胞類型中db/db和db/m小鼠視網(wǎng)膜細胞之間上下調(diào)top 25的差異基因?(Figure 4)。

Figure 5. 視網(wǎng)膜各細胞類型的特異性差異基因

結(jié)果表明，與對照組相比，fos、madd和pttg1在多種細胞類型中均高表達?(Figure 5A)。糖尿病小鼠中編碼CRALBP的RLBP1基因在穆勒神經(jīng)膠質(zhì)細胞中的表達量降低，但在其他幾種視網(wǎng)膜細胞類型中表達量升高。除了這些相對普遍的差異表達基因外，不同細胞類型之間特異性差異表達基因還可以作為DR的選擇性治療靶點，緩解DR特異性病理異常?(Figure 5B)。

5.?過表達RLBP1減輕了糖尿病導(dǎo)致的視網(wǎng)膜神經(jīng)血管病變

Figure 6. RLBP1可緩解糖尿病性視網(wǎng)膜神經(jīng)血管疾病

靶向視網(wǎng)膜差異基因可以使多種視網(wǎng)膜細胞類型正常化，從而提供更全面、更有效的治療手段。在糖尿病影響的多種細胞類型中發(fā)現(xiàn)了一些差異表達基因，包括RLBP1，其目前已在常染色體隱性視網(wǎng)膜疾病中得到廣泛研究。人類RLBP1突變可導(dǎo)致白點狀視網(wǎng)膜變性、視錐視桿營養(yǎng)不良和常染色體隱性視網(wǎng)膜色素變性等。然而，人們對其在DR中的作用知之甚少，這可能是因為一般轉(zhuǎn)錄組測序無法分析RLBP1在各細胞類型中的變化。作者通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)RLBP1在DR穆勒神經(jīng)膠質(zhì)細胞中表達量下調(diào)，而在其他視網(wǎng)膜細胞類型中上調(diào)。

因此，作者假設(shè)穆勒神經(jīng)膠質(zhì)細胞中上調(diào)RLBP1表達可以作為緩解DR神經(jīng)血管變性的靶點。為了驗證該結(jié)論，作者首先通過免疫熒光染色和Western blotting證實了CRALBP在糖尿病視網(wǎng)膜組織中的顯著下調(diào) （Figure 6A-B）。并驗證了在玻璃體腔內(nèi)注射AAV-ShH10Y能夠有效地將轉(zhuǎn)基因傳遞到穆勒神經(jīng)膠質(zhì)細胞 (Figure 6C)，隨后利用AAV載體在db/db小鼠的穆勒神經(jīng)膠質(zhì)細胞中特異性表達RLBP1 (在db/db小鼠玻璃體中注射PBS緩沖液作為對照)，并記錄所有四組小鼠的空腹體重和血糖水平，從而研究RLBP1過表達是否會導(dǎo)致膠質(zhì)功能障礙和促炎細胞因子的誘導(dǎo)。接下來作者用膠質(zhì)標志物GFAP評估膠質(zhì)反應(yīng)，如圖6D所示，在db/m小鼠的視網(wǎng)膜中，星形膠質(zhì)細胞和穆勒神經(jīng)膠質(zhì)細胞末梢的GFAP表達受限。然而，在未處理的db/db小鼠中，在穆勒神經(jīng)膠質(zhì)細胞中檢測到GFAP的表達，表明其膠質(zhì)功能損傷 (Figure 6D)。而在db/db小鼠體內(nèi)注射ShH10Y后，星形膠質(zhì)細胞和穆勒神經(jīng)膠質(zhì)細胞中顯示GFAP的上調(diào)降低 (Figure 6D)，結(jié)果說明RLBP1過表達能夠緩解膠質(zhì)功能障礙。

此外，分析結(jié)果顯示，糖尿病導(dǎo)致促炎細胞因子IL-1β和TNF-α表達量增加，而在db/db小鼠中，過表達RLBP1卻導(dǎo)致這些細胞因子表達量降低 (Figure 6E)。與db/m小鼠相比，db/db小鼠視網(wǎng)膜中的TUNEL陽性細胞數(shù)量顯著增加，表明其DNA鏈斷裂 (Figure 6F)。而與注射PBS的db/db小鼠相比，注射了ShH10Y.RLBP1的 db/db小鼠視網(wǎng)膜中TUNEL陽性細胞數(shù)量明顯減少。在評估神經(jīng)元功能障礙時，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞特異性marker Brn3顯示，與db/m小鼠相比，未處理db/db小鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞顯著減少；而與注射PBS的db/db小鼠相比，注射了ShH10Y.RLBP1的 db/db小鼠視網(wǎng)膜中神經(jīng)節(jié)細胞顯示增加。此外作者還檢測了四組小鼠的α和β波振幅的大小，結(jié)果顯示，過表達RLBP1顯著降低了α和β波振幅的衰減。接下來，作者通過檢查無細胞毛細血管來評估RLBP1對DR血管病變的影響。與預(yù)期結(jié)果一樣，相比于db/m小鼠，注射PBS的db/db小鼠的視網(wǎng)膜無細胞毛細血管數(shù)量顯著增加， 而與注射PBS的db/db小鼠相比，注射ShH10Y.RLBP1的db/db小鼠視網(wǎng)膜無細胞毛細血管數(shù)量顯著減少。之后，使用伊文思藍染色來確定血-視網(wǎng)膜屏障 (BRB) 的通透性程度。結(jié)果顯示，RLBP1過表達的db/db小鼠的血管通透性顯著降低，表明RLBP1過表達能夠緩解糖尿病性視網(wǎng)膜神經(jīng)血管疾病。總結(jié)來說這些數(shù)據(jù)提供了糖尿病和正常情況下視網(wǎng)膜的詳細分析，提供了可能靶向治療DR和相關(guān)功能障礙的致病因素的新見解。

?歐易點評?

本篇文章是典型的單細胞圖譜形式文章，文章最主要的亮點是GWAS分析發(fā)現(xiàn)DR、PDR相關(guān)風(fēng)險位點以及利用實驗驗證了基因功能。在分析手段上，本篇文章尤其在GWAS分析和細胞通訊分析的運用上具有很好的參考意義。

?參考文獻?

Niu T , Fang J , Shi X , et al. Pathogenesis Study Based on High-Throughput Single-Cell Sequencing Analysis Reveals Novel Transcriptional Landscape and Heterogeneity of Retinal Cells in Type 2 Diabetic Mice[J]. Diabetes, 2021.