蛋白定量BCA法，Bradford法，是2種常見(jiàn)的蛋白定量方法，關(guān)于這兩種方法的原理，優(yōu)缺點(diǎn)，以及操作步驟，下面將一一解析。

?

一、蛋白定量BCA（Bicinchoninic Acid）法

?

BCA (bicinchonininc acid)與二價(jià)銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑，混合一起即成為蘋(píng)果綠，即BCA工作試劑。在堿性條件下，BCA與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+，一個(gè)Cu+螯合二個(gè)BCA分子，工作試劑由原來(lái)的蘋(píng)果綠形成紫色復(fù)合物，562nm處有zui高的吸收值，可在540-595nm測(cè)定其吸收值，顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。

?

特點(diǎn)：靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，正常情況下可在45分鐘內(nèi)完成測(cè)定；且試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳。需要注意的是這種方法需要提前制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。Abbkine定量總蛋白的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法），線性標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為50-1000 ug/ml，靈敏度25ug/ ml，zui低檢測(cè)蛋白量達(dá)到5ug。

?

實(shí)驗(yàn)所需儀器及試劑：恒溫水浴鍋、可見(jiàn)光分光光度計(jì)、離心機(jī)、旋渦混合器、試管

?

操作步驟：

1.標(biāo)準(zhǔn)液制備：梯度稀釋牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品。將8個(gè)EP管按照1到8進(jìn)行標(biāo)記，將BSA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成1mg/mL工作液，準(zhǔn)備濃度梯0，50，100，200，400，600，800，1000 ug/mL。

2.BCA工作液制備：將A液和B液搖晃混勻，按照A:B=50:1的比例配置BCA工作液，充分混勻。（BCA工作液室溫下24h內(nèi)穩(wěn)定，故現(xiàn)用現(xiàn)配）

3.加樣孵育：吸取20μL各個(gè)稀釋濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)蛋白質(zhì)樣品，加入96孔板底部或試管中，向孔/管中再加入200uL BCA工作液輕輕搖晃混勻。在37°C下孵育30min，冷卻至室溫。

4.測(cè)定：冷卻到室溫后，以空白為對(duì)照，測(cè)量樣品在562nm或該波長(zhǎng)附近的吸光值

5.將各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)蛋白質(zhì)樣品在562nm處的吸光值減去空白標(biāo)準(zhǔn)品在562nm處的平均吸光值。

?

濃度計(jì)算：

1.在excel表中輸入對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線值和蛋白樣品值。（圖中所示均為舉例說(shuō)明），選定標(biāo)準(zhǔn)曲線的OD值和標(biāo)準(zhǔn)品蛋白濃度。

2.點(diǎn)擊excel表欄：插入-圖表-XY散點(diǎn)圖，并點(diǎn)擊確定。

3.點(diǎn)擊確定后會(huì)自動(dòng)生成XY散點(diǎn)圖，隨意點(diǎn)擊散點(diǎn)圖中的任一的散點(diǎn)，右鍵添加趨勢(shì)曲線。

4.點(diǎn)擊趨勢(shì)線的拓展欄，選擇“更多選項(xiàng)”

5.選擇“更多選項(xiàng)”，彈出“設(shè)置趨勢(shì)圖格式”的畫(huà)面，點(diǎn)擊“顯示公式（E）”以及“顯示R平方值”。一般R2值越接近1，表現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線做得越好，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線帶入的樣品OD值測(cè)出的蛋白濃度也越準(zhǔn)確，一般要求為0.99幾左右。

6.將樣品OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式中，計(jì)算即得到待測(cè)樣品蛋白的濃度。

?

考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）

Bradford法也稱作考馬斯亮藍(lán)法，是由Bradford于1976年建立的。該方法的原理是，帶負(fù)電的考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)中堿性氨基酸相互作用。

?

特點(diǎn)：簡(jiǎn)單便捷、靈敏度高，Abbkine蛋白質(zhì)定量試劑盒（Bradford法），線性標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為50-1000 ug/ml，靈敏度25ug/ ml，zui低檢測(cè)蛋白量達(dá)到5ug。反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量。Bradford?法測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響，如：K+?、Na+?、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、EDTA、DTT、TCEP?和β-巰基乙醇等。

?

需要注意的是：由于高濃度洗滌劑會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的可靠性，必須確保樣品中的SDS的濃度低于1％，Triton X-100低于0.1％，Tween 20,60,80低于0.06％，以及檢測(cè)蛋白濃度的考馬斯亮藍(lán)和染色PAGE膠的考馬斯亮藍(lán)不是同一種物質(zhì)，前者采用考馬斯亮藍(lán)G250，后者采用考馬斯亮藍(lán)R250，G250和R250分子基本骨架一樣，但是G250多了兩個(gè)甲基，與蛋白反應(yīng)迅速，染膠慢且脫色困難，故用于蛋白定量；R250與蛋白反應(yīng)較緩慢，染膠較快且易于洗脫，故用于PAGE膠染色。

?

以上兩種蛋白定量方法：BCA蛋白質(zhì)定量法&Bradford蛋白質(zhì)定量法的使用場(chǎng)景，應(yīng)該根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件來(lái)選擇，這樣實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)才會(huì)更可靠~

?

文章來(lái)源：蛋白定量BCA法?VS Bradford法，你支持哪一種？

http://www.abbkine.cn/protein-quantification-bca-bradford