CRISPR是一個不斷突破現(xiàn)有認(rèn)知的技術(shù)工具，不僅可以實現(xiàn)基因敲除/突變/敲入，現(xiàn)在它還可以做基因過表達(dá)/基因沉默/基因調(diào)控等，接下來就聽我為您仔細(xì)介紹一下這位“斜桿青年”。

在生物學(xué)研究中，CRISPR-gRNA文庫是一種高通量篩選靶基因的工具，可大規(guī)?；蛉蚪M進(jìn)行功能篩選，涉及信號通路、疾病、細(xì)胞藥物應(yīng)答、發(fā)育、基因調(diào)控等方面，高分的研究成果層出不窮。

01、CRISPRa（基因激活）

CRISPRa（基因激活）系統(tǒng)是用于激活內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄的強大工具，切割失活的Cas9（dCas9）連上轉(zhuǎn)錄激活子（如VP64、p65和HSF1），可以有效促進(jìn)基因組特定位點的轉(zhuǎn)錄。研究顯示，CRISPRa技術(shù)可以使得基因的轉(zhuǎn)錄得到了兩倍到數(shù)千倍的增長，許多基因的活性甚至有了幾個數(shù)量級的增加。

客戶提供相關(guān)的需要激活表達(dá)的基因信息， 我將按照基因的生物信息特點，設(shè)計gRNA、構(gòu)建載體、包裝病毒通過病毒轉(zhuǎn)染到目的細(xì)胞，篩選出激高表達(dá)或者合適的gRNA序列，并構(gòu)建成CRISPRa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，并使用Q-PCR對目的基因表達(dá)量進(jìn)行檢測，并依據(jù)客戶的需求提供單克隆建立和表型的篩選服務(wù)。

| ??服務(wù)優(yōu)勢：通過內(nèi)源基因組背景進(jìn)行激活，激活表達(dá)量可以從2倍到幾個數(shù)量級的提升。

| ??CRISPRa vs ORF過表達(dá)

02、CRISPRi（基因抑制/沉默）

CRISPRi （基因抑制/沉默）系統(tǒng)是用于抑制內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄的強大工具，當(dāng)dCas9（沒有切割活性的Cas9）被引導(dǎo)到靶基因的轉(zhuǎn)錄起始位點TSS（transcription start site）時，dCas9能夠物理性阻礙RNA聚合酶的通過，導(dǎo)致基因沉默。同時dCas9融合了一個基因抑制結(jié)構(gòu)域，如KRAB結(jié)構(gòu)域，這樣的蛋白稱之為dCas9-KRAB，可以進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)錄抑制的效率。此外，dCas9也可以融合雙抑制結(jié)構(gòu)域KRAB-MeCP2，抑制效果更佳。

由于dCas9-KRAB CRISPRi系統(tǒng)是在DNA水平抑制基因表達(dá)，因此適用于多種類型的基因，包括：mRNA、非編碼RNA、microRNA、反義轉(zhuǎn)錄本、核定位RNA以及聚合酶III 轉(zhuǎn)錄本等基因的轉(zhuǎn)錄抑制。

CRISPRi顯著的轉(zhuǎn)錄抑制效果

| ? 服務(wù)內(nèi)容：

客戶只需要提供要進(jìn)行敲減的基因和轉(zhuǎn)錄本信息，將有海星生物設(shè)計gRNA序列，構(gòu)建病毒載體，病毒包裝后轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，并根據(jù)客戶的需求進(jìn)行篩選出符合敲減水平低gRNA，并提供CRISPRi穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建和單克隆的擴增篩選的服務(wù)。
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| ? 技術(shù)優(yōu)勢：

不改變內(nèi)源基因組背景、基因抑制效果可篩選、適用更多基因種類。
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| ? RNAi vs CRISPRi

研究基因功能最常見的方法是，減少或者阻斷基因表達(dá)，然后進(jìn)行表型分析。RNAi和CRISPRi都是常用的基因表達(dá)水平敲低的研究工具。

RNA干擾（RNAi）靶向細(xì)胞質(zhì)中成熟的RNA，而CRISPRi則在細(xì)胞核內(nèi)阻止轉(zhuǎn)錄的起始，因而敲低效果更為顯著。此外RNAi的脫靶效應(yīng)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CRISPRi。

?CRISPRi的敲低效果顯著優(yōu)于RNAi

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