前言

細(xì)胞是生命體的最小組成單位，蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的執(zhí)行者，而細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組豐度的動(dòng)態(tài)變化對各種生命過程有重要影響，不僅能為生命活動(dòng)規(guī)律提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也是理解細(xì)胞功能和發(fā)展過程的中心環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的蛋白組學(xué)是針對組織或者大量細(xì)胞樣本進(jìn)行分析，獲得的是均質(zhì)化后的結(jié)果，掩蓋了單個(gè)細(xì)胞的個(gè)體差異，而組織、器官或個(gè)體中，細(xì)胞具有非常大的異質(zhì)性，傳統(tǒng)的研究方法不能完全捕其復(fù)雜性、多樣性以及功能的不同。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，生命科學(xué)研究早已進(jìn)入了單細(xì)胞時(shí)代，在mRNA水平已經(jīng)可以很好的從單細(xì)胞的維度上探究細(xì)胞、組織、器官的發(fā)育過程和疾病相關(guān)的細(xì)胞異質(zhì)性和同質(zhì)性問題。但由于轉(zhuǎn)錄和蛋白相關(guān)性并不是太高，也不能完全反映蛋白的調(diào)控作用，所以要更好地理解細(xì)胞過程的調(diào)控機(jī)制，檢測效應(yīng)分子蛋白質(zhì)比mRNA更直接有效，對于理解細(xì)胞的功能更為至關(guān)重要。近幾年，特別是基于質(zhì)譜方法的單細(xì)胞蛋白組技術(shù)的快速發(fā)展，在很大程度上可以彌補(bǔ)單細(xì)胞水平蛋白研究的需求。但是，單細(xì)胞蛋白組檢測和分析技術(shù)主要面臨兩大挑戰(zhàn)：第一大挑戰(zhàn)是如何高通量的獲取單細(xì)胞蛋白組樣品。第二大挑戰(zhàn)是如何準(zhǔn)確檢測和分析單細(xì)胞蛋白組樣品數(shù)據(jù)。

于是，許多研究團(tuán)隊(duì)、公司競相發(fā)力，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析技術(shù)從概念到科研、商用已經(jīng)成為了現(xiàn)實(shí)。現(xiàn)在關(guān)于單細(xì)胞蛋白組的科研報(bào)告也越來越多，涌現(xiàn)出許多成熟的單細(xì)胞蛋白組定量技術(shù)，如：基于LC-MS/MS的TMT標(biāo)記定量檢測單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的技術(shù)：SCoPE-MS和nanoliter-scale shotgun mass spectrometry of single cells 技術(shù)、基于抗體的熒光定量技術(shù)：Cell Atlas和 Single-cell mass cytometry、基于WB的Single-cell western blotting以及基于PCR免疫分析的Proseek Multiplex技術(shù)和基于電子識別的nanopore protein sequencing技術(shù)。

下面小鹿選擇了7篇具有代表性的文章，具體的詳談這些技術(shù)及其應(yīng)用。

單細(xì)胞蛋白質(zhì)組研究報(bào)道解讀

一. 基于LC-MS/MS的TMT標(biāo)記定量檢測單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的技術(shù)：SCoPE-MS和nanoPOTS chips技術(shù)

SCoPE-MS單細(xì)胞蛋白組定量檢測技術(shù)

代表文章

標(biāo)題：SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation.

期刊：Genome Biology (2018)

IF：14.028

原文鏈接：

https://doi.org/10.1186/s13059-018-1547-5

技術(shù)說明

SCoPE-MS技術(shù)是以顯微鏡篩選的方法構(gòu)建單細(xì)胞樣品、并采用液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)（liquid chromatography and tandem mass spectrometry, LC-MS/MS蛋白鑒定）和同位素標(biāo)記定量（isobaric tandem mass tags, TMT標(biāo)記定量蛋白組學(xué)?）技術(shù)改進(jìn)、組合而成。

材料和方法

研究者選用人的U937和Jurkat細(xì)胞品系進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、單細(xì)胞樣品制備和Bluk細(xì)胞樣品制備（用以對比分析）、細(xì)胞超聲破碎（超聲波破碎優(yōu)于化學(xué)試劑的破碎方法）、蛋白變性消化、TMT標(biāo)記（技術(shù)手段）、LC-MS/MS掃描（技術(shù)手段）（混合上機(jī)）、MaxQuant搜庫以及生物信息學(xué)分析。

研究結(jié)果

研究者采用SCoPE-MS方法對兩種細(xì)胞譜系的細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞蛋白組的定量分析，定量到767個(gè)蛋白，與Bluk細(xì)胞樣品的定量結(jié)果相比是少了一些，但是比較二者的蛋白樣品輸入量也不是一個(gè)級別的。雖然定量到的蛋白數(shù)量少了一些，但是通過整合SCoPE-MS單細(xì)胞和Bluk細(xì)胞樣品的蛋白定量數(shù)據(jù)，并進(jìn)行主成分分析發(fā)現(xiàn)，SCoPE-MS方法是可準(zhǔn)確的區(qū)分兩種不同的細(xì)胞的蛋白質(zhì)組。

nanoliter-scale shotgun mass spectrometry of single cells 技術(shù)

代表文章

標(biāo)題：

Single-cell Proteomics Reveals Changes in Expression During Hair-Cell Development

期刊：eLife（2019）

IF：7.551

原文鏈接：

DOI:https://doi.org/10.7554/eLife.50777

技術(shù)說明

研究者采用可以精確的定量到納升級別nanoliter-scale 的nanoPOTS chip對單細(xì)胞的蛋白組樣品進(jìn)行shotgun mass spectrometry (LC-MS/MS（技術(shù)手段）) 掃描定量。

材料和方法

首先在E15雞胚細(xì)胞樣品中獲取Hair cell和Support cell，然后用BD Influx Instrument (BD Biosciences) 篩選細(xì)胞后轉(zhuǎn)移到納米微孔(nanowells)中，其中細(xì)胞樣品在納米微孔芯片上的排列方式是可以通過BD FACS software environment軟件上實(shí)現(xiàn)個(gè)性化定制，可以滿足研究者的各種需求。在顯微鏡下，通過程序自動(dòng)化識別nanowell內(nèi)的細(xì)胞個(gè)數(shù)，而且可以通過SYTOX Red Dead Cell Stain (Thermo Fisher) 對活的細(xì)胞和死的細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分和篩選，從而達(dá)到優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的目的。定量到細(xì)胞蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之后，采用細(xì)胞發(fā)育軌跡(Developmental trajectory)的預(yù)測方法，研究progenitor cells到hair cell和support cell的細(xì)胞分化軌跡。

研究結(jié)果

研究者利用單細(xì)胞蛋白組定量技術(shù)檢測雞胚細(xì)胞樣品，總共定量到3000多個(gè)蛋白，后續(xù)hair cell和support cell發(fā)育軌跡分析發(fā)現(xiàn)Marker蛋白表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化（升高：OCM, CRABP1, GPX2,AK1, GSTO1；降低TMSB4X, AGR3 ）

二. 基于抗體的熒光定量技術(shù)：Cell Atlas和 Single-cell mass cytometry技術(shù)

Cell?Atlas

代表文章

標(biāo)題：A subcellular map of the human proteome.

期刊：Science （2017）

IF：41.037

原文鏈接：10.1126/science.aal3321 (2017).

技術(shù)說明

基于抗體的蛋白熒光定量檢測技術(shù)

材料和方法

材料：抗體、人的細(xì)胞譜系。

方法：通過整合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和基于抗體的蛋白熒光定量檢測技術(shù)構(gòu)建人的細(xì)胞圖譜，并最終用質(zhì)譜的方法進(jìn)行驗(yàn)證。

研究結(jié)果

在單細(xì)胞水平上定位了12003個(gè)人類蛋白質(zhì)的30個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而確定了13個(gè)主要的細(xì)胞器蛋白質(zhì)組。

Single-cell Mass Cytometry

代表文章

標(biāo)題：

Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum.?

期刊：Science. (2011)

IF：41.037

原文鏈接：

doi:10.1126/science.1198704.

技術(shù)說明

利用熒光流式細(xì)胞技術(shù)對單細(xì)胞蛋白進(jìn)行定量的技術(shù)

材料和方法

材料：

人外周血單核細(xì)胞(PBMC)

方法：

流式細(xì)胞儀技術(shù)的工作流程與熒光流式細(xì)胞儀技術(shù)類似，如下圖所示，利用過渡元素同位素偶聯(lián)的抗體結(jié)合細(xì)胞上和細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)靶點(diǎn)，將帶有結(jié)合抗體同位素結(jié)合物的細(xì)胞以單細(xì)胞液滴的形式噴射到約5500 K的感應(yīng)耦合氬等離子體（通過高頻電流的感應(yīng)線圈轟擊氬氣而產(chǎn)生）中。這會(huì)使每個(gè)細(xì)胞蒸發(fā)并導(dǎo)致其原子成分的電離。然后用飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對得到的元素離子進(jìn)行取樣和定量。當(dāng)每個(gè)細(xì)胞的組成離子到達(dá)探測器時(shí)，每個(gè)過渡元素同位素報(bào)告器的信號被整合。

研究結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)是分析造血功能復(fù)雜性的重要工具。研究者使用單細(xì)胞“流式細(xì)胞術(shù)”來檢測健康人骨髓，同時(shí)在單個(gè)細(xì)胞中測量34個(gè)生物學(xué)相關(guān)參數(shù)（31個(gè)抗體的結(jié)合、活性、DNA含量和相對細(xì)胞大?。?。并用18個(gè)功能性信號狀態(tài)的同時(shí)標(biāo)記物監(jiān)測跨越造血系統(tǒng)的細(xì)胞亞群的信號行為，這些功能性信號狀態(tài)受到一組體外刺激和抑制劑的干擾。該數(shù)據(jù)集允許由表面抗原表達(dá)定義的相關(guān)細(xì)胞類型的算法驅(qū)動(dòng)以提供細(xì)胞信號反應(yīng)與藥物抑制的疊加圖。

用這種方式觀察、分析揭示了先前未被重視的兩種情況：精確的信號反應(yīng)，它們被限制在傳統(tǒng)定義的細(xì)胞亞群內(nèi)；連續(xù)的磷酸化反應(yīng)，它們以意想不到的方式跨越細(xì)胞群體邊界，但卻與細(xì)胞表型密切相關(guān)。

總的來說，這種單細(xì)胞分析提供了健康人造血中免疫信號的系統(tǒng)范圍的數(shù)據(jù)，可用于機(jī)制研究和藥理學(xué)干預(yù)。

三、基于WB的Single-cellwestern blotting (scWesterns) 技術(shù)

代表文章

標(biāo)題：

Single-cell western blotting.

期刊：Nat Methods. （2014）

IF：28.467

原文鏈接：

doi:10.1038/nmeth.2992.

技術(shù)說明

單細(xì)胞蛋白免疫印跡檢測技術(shù)(Single cell Westerns Blotting, scWesterns)，是對傳統(tǒng)的蛋白免疫印跡(Western blotting)方法的精細(xì)化改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了在單細(xì)胞層面上高通量的對于單細(xì)胞蛋白組進(jìn)行免疫印跡檢測、定量和分析，與傳統(tǒng)的western blots不同，scWesterns方法可以精確量化了由外界刺激所引起的單個(gè)細(xì)胞的蛋白水平上的變化。

scWesterns技術(shù)應(yīng)用可以應(yīng)用于基礎(chǔ)研究中細(xì)胞免疫應(yīng)答、細(xì)胞分化等相關(guān)課題，也可以應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如藥物研發(fā)中細(xì)胞實(shí)驗(yàn)階段，可以整合上游功能或形態(tài)篩選、量化細(xì)胞對藥物制劑 (包括罕見的循環(huán)腫瘤細(xì)胞) 的反應(yīng)。

材料和方法

材料：

大鼠的神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell, NSC)。

scWesterns技術(shù)主要由單細(xì)胞微孔放置(settling of single cells into microwells)、原位裂解(lysis in situ)、凝膠電泳(gel electrophoresis)、光控蛋白免疫印記(photoinitiated blotting to immobilize proteins)、抗體探測(antibody probing)等技術(shù)組成，整個(gè)過程用時(shí)4h。

scWesterns實(shí)驗(yàn)整個(gè)過程都是在改造的顯微鏡載玻片(microscope slide)上進(jìn)行，載玻片上有通過軟光刻技術(shù)制作而成的可以固定單個(gè)細(xì)胞的凝膠槽矩陣，該陣列由16個(gè)模塊組成，每個(gè)模塊有14組微孔，每組有30微孔，總共達(dá)6720個(gè)微孔，在每個(gè)微孔中都是一個(gè)微型的反應(yīng)器，對細(xì)胞矩陣進(jìn)行光學(xué)掃描之后，將凝膠槽轉(zhuǎn)移至微型電泳槽中，進(jìn)行蛋白凝膠電泳。所以整個(gè)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)高通量的對單細(xì)胞蛋白進(jìn)行western blotting檢測和分析。

研究結(jié)果

研究者采用scWesterns技術(shù)對大鼠的神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)的分化和對有絲分裂原刺激的反應(yīng)進(jìn)行探究。研究顯示NSC都顯示出短暫的、動(dòng)態(tài)的ERK和MEK磷酸化應(yīng)答反應(yīng)。

scWestern通過與靶抗體結(jié)合對靶蛋白進(jìn)行定量，每個(gè)細(xì)胞可以檢測閾值小于30000個(gè)分子的11個(gè)蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，并與熒光激活細(xì)胞分類結(jié)合時(shí)支持低起始細(xì)胞數(shù)（~200）的分析。

scWestern克服了單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析（即抗體保真度、靈敏度和起始細(xì)胞數(shù)）的局限性，或?qū)⒊蔀檠芯繂渭?xì)胞分辨率下復(fù)雜細(xì)胞群的通用工具。

四.基于WB的Single-cellwestern blotting (scWesterns) 技術(shù)

代表文章

標(biāo)題：

Simultaneous Multiplexed Measurement of RNA and Proteins in Single Cells.

期刊：Cell Reports（2016）

IF：7.815

原文鏈接：

http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2015.12.021

技術(shù)說明

通過構(gòu)建的特制的寡核苷酸序列，在該序列一段結(jié)合特定的蛋白抗體，在熒光定量PCR反應(yīng)中達(dá)到同時(shí)對單細(xì)胞的RNA和蛋白進(jìn)行定量的技術(shù)。

材料和方法

材料：

Early passage U3035MG cells，是一種來源于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的腫瘤細(xì)胞。

方法：

利用一種基于同質(zhì)親和力的鄰近延伸分析法(homogeneous affinity-based proximity extension assay, PEA) 對蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測，該方法利用與寡核苷酸結(jié)合的抗體對蛋白質(zhì)進(jìn)行靶向檢測，寡核苷酸的30個(gè)自由端是成對互補(bǔ)的，所以當(dāng)同源抗體對與靶蛋白結(jié)合時(shí)，所附的寡核苷酸鏈將被拉近，并且可以通過聚合來擴(kuò)展以產(chǎn)生可擴(kuò)增的DNA報(bào)告分子，隨后通過高通量實(shí)時(shí)PCR對其進(jìn)行定量。對成對蛋白檢測的要求保證了夾心免疫分析法檢測蛋白質(zhì)(sandwich immunoassay-quality protein detection)的質(zhì)量。多重Readout是通過使用同源抗體結(jié)合物對的特異性引物對通過實(shí)時(shí)PCR解碼延伸產(chǎn)生的DNA報(bào)告因子來實(shí)現(xiàn)的。

利用商業(yè)的TaqMan基因表達(dá)分析，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法來探測轉(zhuǎn)錄物，同時(shí)實(shí)現(xiàn)檢測定量蛋白質(zhì)的方法。

研究結(jié)果

利用單個(gè)細(xì)胞的RNA和蛋白質(zhì)組合數(shù)據(jù)，研究者證明了在神經(jīng)干細(xì)胞條件下生長的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的低傳代細(xì)胞培養(yǎng)群體中存在顯著的異質(zhì)性。其表達(dá)模式能準(zhǔn)確區(qū)分對照細(xì)胞和BMP4處理的細(xì)胞。此外，還證明了RNA和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)在定義細(xì)胞狀態(tài)方面貢獻(xiàn)是不同的。

五.基于納米孔電子識別的nanopore protein sequencing技術(shù)

代表文章

標(biāo)題：

Electrical recognition of the twenty proteinogenic amino acids using an aerolysin nanopore.

期刊：Nature Biotechnology（2019）

IF：31.864

原文鏈接：

DOI:10.1038/s41587-019-0345-2 BibTex

技術(shù)說明

用溶氧素納米孔對20種蛋白源氨基酸的進(jìn)行電特征識別

材料和方法

分子動(dòng)力學(xué)模擬的應(yīng)用表明，溶氧素納米孔具有一個(gè)內(nèi)置的單分子陷阱，將多陽離子載體結(jié)合的氨基酸完全限制在溶血素的傳感區(qū)域內(nèi)。這種結(jié)構(gòu)特征意味著每個(gè)氨基酸在孔中花費(fèi)足夠的時(shí)間來敏感地測量氨基酸的排除體積。

研究結(jié)果

研究者用短的多陽離子載體檢測溶氧素納米孔中所有20種蛋白原氨基酸的離子電流。

小鹿推薦

通過研讀這7篇單細(xì)胞蛋白組檢測技術(shù)的相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)特點(diǎn)就是現(xiàn)存的單細(xì)胞蛋白組檢測技術(shù)主要是對已經(jīng)存在的技術(shù)的精細(xì)化改進(jìn)而來的，例如SCoPE-MC、Proseek Multiplex 和scWesterns技術(shù)，不同技術(shù)各具特點(diǎn)。

?

近幾年，隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，特別是基于tims tof平臺將蛋白質(zhì)組研究推進(jìn)到全新的“4D蛋白質(zhì)組”層面，打破了基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的瓶頸，大幅度的提高掃描速度和檢測靈敏度，為極微量蛋白樣本檢測提供了全新的研究手段?；谫|(zhì)譜方法的單細(xì)胞蛋白組技術(shù)的快速發(fā)展，在很大程度上可以彌補(bǔ)單細(xì)胞水平蛋白組高通量高深度的研究需求。相信得益于無損的微量樣本前處理以及色譜系統(tǒng)的不斷改進(jìn)和提升，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)在生命科學(xué)及疾病診斷、機(jī)制及治療中會(huì)終將成為更加廣泛的應(yīng)用技術(shù)發(fā)揮關(guān)鍵性作用。同時(shí)，采用基于單細(xì)胞蛋白組研究手段能為極微量樣本，比如微量單一類群細(xì)胞、微量穿刺樣本、激光顯微切割及其他珍稀樣本的研究提供了更好的研究工具，為相關(guān)樣本研究帶來更高深更穩(wěn)定更精準(zhǔn)的檢測結(jié)果。

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End本文系鹿明生物原創(chuàng)