前言

宮頸鱗狀上皮就是指覆蓋在宮頸表面的上皮組織，在正常情況下呈粉紅色，而且復(fù)層鱗狀上皮，抵抗力非常好，所以宮頸不容易招致細菌的感染。但是鱗狀上皮也會發(fā)生病變，尤其是感染了高危HPV之后，宮頸的鱗狀上皮就會發(fā)生病變，甚至發(fā)展成宮頸癌。

宮頸癌是人乳頭瘤病毒HPV持續(xù)感染條件下，由宮頸鱗狀上皮內(nèi)的病變逐漸發(fā)展而來的,所以它的病變過程就是從宮頸的低級別鱗狀上皮內(nèi)病變,逐漸變化為宮頸的高級別鱗狀上皮內(nèi)病變,進一步就會變成了癌變。近年來，靶向TME策略為癌癥治療提供了一種新的治療選擇；然而，由于宮頸癌的免疫微環(huán)境在很大程度上是未知，這些方案還未被廣泛應(yīng)用于宮頸癌患者。

2022年6月24日，上海市復(fù)旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院華克勤教授團隊，第一作者李春波于Frontiers in Immunology（IF 8.786）, DOI: 10.3389/fimmu.2022.897366在線發(fā)表了宮頸癌單細胞測序的最新研究成果。

作者對3例正常宮頸，2例高階段的上皮內(nèi)病變（High-stage intraepithelial neoplasia，HSIL），4例宮頸腫瘤和1例轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的新鮮組織樣本進行10× Genomics高通量單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，繪制了宮頸癌不同階段免疫微環(huán)境和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，不同的免疫微環(huán)境意味著不同的免疫治療策略。這項研究加深了人們對宮頸癌進展過程中腫瘤免疫微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）動態(tài)變化的理解，并對開發(fā)抑制不同發(fā)展階段宮頸癌治療方法具有重要意義。

期刊：Frontiers in Immunology

影響因子：8.786

發(fā)表年月：2022年6月

材料：3例正常宮頸，2例HSIL，4例腫瘤和1例淋巴轉(zhuǎn)移灶的新鮮組織樣本

方法：10x Genomics高通量單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（由歐易生物提供技術(shù)支持）

研究背景

本研究首次通過scRNA-seq分析了免疫細胞和基質(zhì)細胞在宮頸癌進展過程中轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的變化，包括正常組織、HSIL、腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。本研究將有助于更深入地了解宮頸癌進展過程中TME的細胞特征，并有助于開發(fā)抑制宮頸癌的起始和進展的新治療方法。

研究結(jié)果

Result1  單細胞測序揭示了宮頸癌進展過程中獨特的免疫景觀

為了揭示宮頸癌進展過程中免疫微環(huán)境的變化特征，作者對3例正常宮頸，2例HSIL，4例宮頸腫瘤和1例轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的新鮮組織樣本進行10× Genomics單細胞測序。

經(jīng)過初步質(zhì)量控制，最終保留59913個細胞，其中有30968個細胞來自正常宮頸，有10944個細胞來自正HSIL，有11660個細胞來自正宮頸，剩余6341個細胞來淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。隨后利用t-SNE降維聚類，根據(jù)細胞基因表達值將其化為9個不同的簇（T/NK細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、肥大細胞、B細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞）。

作者將細胞類型的標記基因表達情況用t-SNE圖譜來展示出來。

接下來對這9種類型的細胞在正常宮頸、HSIL、宮頸腫瘤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中細胞數(shù)目和比例做出統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)不同患者、不同病灶見細胞分布差異很大?？梢园l(fā)現(xiàn)正常組織中，大多數(shù)細胞類型是成纖維細胞（49.4%），內(nèi)皮細胞（23.8%）和平滑肌細胞（20.3%），而免疫細胞（T / NK細胞、巨噬細胞、B細胞、漿細胞和肥大細胞）的數(shù)量為5.2%，幾乎不存在中性粒細胞。

在HSIL組織中，大多數(shù)細胞類型是免疫細胞，其中T / NK細胞（49.4%），巨噬細胞（17.6%），嗜中性粒細胞（13.5%），而間充質(zhì)細胞（成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞）的數(shù)量相對較少。這些結(jié)果表明，宮頸癌進展的早期階段存在明顯的免疫浸潤。在腫瘤組織中，T/NK細胞（39.4%）、內(nèi)皮細胞（14.9%）和成纖維細胞（15.6%）最多。在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中T / NK細胞（61.6%）和巨噬細胞（25.8%）的比例較高，其他類型細胞的比例較低。

Result2  不同病變中NK/T細胞的單細胞表達譜的特征分析

由于我們知道NK/T細胞在腫瘤免疫中往往起到一個核心作用，于是作者重點關(guān)注了這一類細胞的特征。根據(jù)基因表達譜，鑒定出12種T細胞。

隨后對T細胞在（上皮內(nèi)病變 、淋巴轉(zhuǎn)移灶 、正常宮頸、原位腫瘤 ）中的功能進行GO和KEGG富集分析，以及對一些作者重點關(guān)注的功能在四個樣本中進行評分。上皮內(nèi)病變中顯著富集富集的T細胞受體信號通路，白細胞跨內(nèi)皮遷移，B/NK/T細胞活化相關(guān)信號通路。腫瘤組織中，與“抗原加工遞呈”、“NK細胞藥物作用的細胞毒性”、“NK細胞活化”相關(guān)的過程呈現(xiàn)高度富集。淋巴轉(zhuǎn)移灶的功能主要與“樹突狀細胞趨化性富集”、“肥大細胞激活”以及“趨化性的正向調(diào)節(jié)”的過程有關(guān)。

隨后結(jié)合每組樣本中T細胞的數(shù)目和比例，作者發(fā)現(xiàn)上皮內(nèi)病變中cluster 2、3、12簇高富集，提示適應(yīng)性或先天免疫激活程度低，這可能與持續(xù)HPV感染和異常細胞浸潤有關(guān)。腫瘤組織表現(xiàn)出cluster 4、5、9簇的高浸潤，這與免疫抑制狀態(tài)有關(guān)。

然而，轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中富含幼稚的和效應(yīng)記憶細胞，這代表了免疫激活的早期階段。并且作者還發(fā)現(xiàn)，上皮內(nèi)病變中免疫相關(guān)基因的高表達利于預(yù)后，而與腫瘤組織預(yù)后較差相關(guān)。

Result3  HSIL、腫瘤和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中NK/T細胞的不同免疫狀態(tài)

由于免疫細胞類型表現(xiàn)出不同的組織偏好，作者重點關(guān)注CD8+ T細胞的免疫狀態(tài)和細胞動態(tài)轉(zhuǎn)變，并對每組樣本中CD8+ T細胞的數(shù)目和比例進行統(tǒng)計。通過小提琴圖展示了C2-tissue resident memory CD8 T cells，C4-exhausted CD8 T cells，C5-effector memory CD8 T cells，C8-cytotoxic CD8 T cells每個細胞簇中具有代表性標記基因表達情況。

接著作者對C2、C4、C5、C8這幾個cluster的功能進行GO和KEGG富集分析，隨后對一些重點關(guān)注的功能在C2、C4、C5、C8中進行評分，這些研究結(jié)果首次證明了HSIL是一種低激活的免疫狀態(tài)（先天免疫），其特征是存在豐富的組織駐留記憶CD8+T細胞的浸潤。腫瘤組織則表現(xiàn)為免疫抑制狀態(tài)，其特征是存在耗竭型CD8+T細胞浸潤。淋巴轉(zhuǎn)移灶的免疫反應(yīng)激活程度較低，以效應(yīng)記憶CD8+T細胞和細胞毒性CD8+T細胞為特征，提示免疫反應(yīng)處于早期激活階段。

作者使用Monocle2對CD8+ T細胞進行擬時間軌跡分析，模擬出CD8+ T細胞的狀態(tài)轉(zhuǎn)變過程。C2細胞處于運動軌跡的起點，分別分化為C4細胞（Fate1）與C5/C8細胞（Fate2）的兩個方向。Fate1分化為C4細胞，而C4代表了一個耗竭的細胞簇，作者發(fā)現(xiàn)腫瘤中約占43.1%的CD8+ T細胞位于Fate1分支，這意味著腫瘤中大部分CD8+ T細胞正經(jīng)歷了一個耗竭過程。Fate2分化為C5/C8細胞，這些細胞可以通過分泌各種細胞因子來調(diào)節(jié)其他免疫細胞的功能，淋巴結(jié)中大部分CD8+ T細胞位于Fate2分支。

Result4  不同病變樣本間的髓系細胞的特征

通過對所有的髓系細胞進行了無監(jiān)督聚類分析，根據(jù)基因表達譜，作者得到7種巨噬細胞和3種樹突細胞，通過小提琴圖和熱圖展示了每個細胞簇中具有代表性標記基因表達情況。

作者對7種巨噬細胞和3種樹突細胞的功能進行GO和KEGG富集分析。

然而，通過計算M1和M2型巨噬細胞得分以及抗炎、免疫監(jiān)視和免疫逃避得分，可以觀察到主導(dǎo)M2型巨噬細胞得分（促癌）在腫瘤組織，和M1型巨噬細胞得分在上皮內(nèi)病變（抑癌）。

值得注意的是，上皮內(nèi)病變中的巨噬細胞比腫瘤中表現(xiàn)出更高的抗炎和促炎評分，這表明了TME的復(fù)雜性。腫瘤組織表現(xiàn)出免疫監(jiān)視和逃逸評分，這進一步解釋了免疫治療的不良反應(yīng)。

Result5  HSIL組織與腫瘤組織中巨噬細胞類型差異

由于C1-Ma-C1QA和C2-Ma-THBS1巨噬細胞分別是腫瘤/淋巴結(jié)和上皮內(nèi)病變中主要富集的細胞類型?；鹕綀D顯示了兩種巨噬細胞之間顯著差異的基因。熱圖展示了C1-Ma-C1QA和C2-Ma-THBS1巨噬細胞中具有代表性標記基因表達情況。

接下來對C1-Ma-C1QA和C2-Ma-THBS1巨噬細胞分別進行GO和KEGG富集分析。

對每組樣本中C1-Ma-C1QA和C2-Ma-THBS1巨噬細胞的數(shù)目和比例進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)C1-Ma-C1QA巨噬細胞是腫瘤和淋巴轉(zhuǎn)移灶中的主要細胞類型，而C2-Ma-THBS1巨噬細胞是HSIL中的主要細胞類型。與此同時C1QA高表達有利于預(yù)后，但THBS1高表達與預(yù)后不良相關(guān)。

利用Monocle2，作者對C1-Ma-C1QA和C2-Ma-THBS1兩種類型的巨噬細胞進行擬時間軌跡分析。可以觀察到C2-Ma-THBS1和C1-Ma-C1QA軌跡形成了一個連續(xù)體，但具有不同的表達特征。之前的分析表明C2-Ma-THBS1的上調(diào)基因主要在病毒轉(zhuǎn)錄、IL-1信號通路、NK-kB信號通路和細胞因子介導(dǎo)的信號通路中富集，這些信號通路的激活意味著腫瘤的進展。

C1-Ma-C1QA表現(xiàn)為中性粒細胞活化、T細胞活化、抗原加工和呈遞等信號通路的高度富集。這些結(jié)果推斷，當病變從HSIL發(fā)展為侵襲性腫瘤時，TME經(jīng)歷了C2-Ma-THBS1到C1-Ma-C1QA的轉(zhuǎn)變。

Result6  不同病變樣本間的B細胞的特征

通過對所有的B細胞進行了無監(jiān)督聚類分析，根據(jù)基因表達譜，作者得到6種B細胞。通過小提琴圖和熱圖展示了每個細胞簇中具有代表性標記基因表達情況?；谔囟ǖ募毎麡擞浳铮髡邔luster 1定義為濾泡B細胞，將Cluster2-5定義為漿細胞，將Cluster6定義為前B細胞。

作者對6種B細胞的功能進行GO和KEGG富集分析。

利用Monocle2，作者對6種B細胞進行擬時間軌跡分析，可以觀察到濾泡B細胞向漿細胞轉(zhuǎn)化的趨勢。

Result7  HSIL、腫瘤和淋巴結(jié)中復(fù)雜的細胞間通信網(wǎng)絡(luò)

為了更加系統(tǒng)地闡明細胞間復(fù)雜的相互作用，作者繪制了細胞間配體-受體通信網(wǎng)絡(luò)，以更好地理解HSIL、腫瘤和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中相鄰細胞間的相互作用。

結(jié)果顯示，HSIL和淋巴結(jié)中的MHC分子、MIF-CD74/CXCR4和MIF-CD74/CD44均高于腫瘤組織。而腫瘤組織則表現(xiàn)出更高水平的免疫檢查點相關(guān)配體受體，如LGALS9-HAVCR2、LAGALS9-CD44、ICOSL-ICOS、ICOSL-CTLA4和ICOSL-CD28，這些結(jié)果進一步證實了腫瘤組織中免疫抑制TME的存在。

文章總結(jié)

這項研究分析了正常宮頸、癌前病變(HSIL)、原發(fā)性宮頸腫瘤和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的單細胞圖譜。首次證明了HSIL是一種低激活的免疫狀態(tài)（先天免疫），其特征是存在豐富的組織駐留記憶CD8+T細胞的浸潤。腫瘤組織則表現(xiàn)為免疫抑制狀態(tài)，其特征是存在耗竭型CD8+T細胞浸潤。淋巴轉(zhuǎn)移灶的免疫反應(yīng)激活程度較低，以效應(yīng)記憶CD8+T細胞和細胞毒性CD8+T細胞為特征，提示免疫反應(yīng)處于早期激活階段。文章闡明了從癌前病變到侵襲性腫瘤再到淋巴轉(zhuǎn)移灶，這個過程中TME的變化特征。這些發(fā)現(xiàn)為深入了解宮頸癌的特征，以及未來開發(fā)潛在的治療方法提供了深入的見解。

歐易生物提供了該項目的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒灪头治龉ぷ鳌?/strong>

特別致謝：感謝歐易生物巴永兵和子清珍在分析中提供的幫助。

歡迎百度搜索歐易生物——訪問歐易生物官網(wǎng)——了解單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)

猜你想看

1、Nat Commun | 單細胞測序深度合作文章發(fā)表一區(qū)頂刊，助力解析家蠶絲腺單細胞圖譜

2、CELL METAB | 單細胞轉(zhuǎn)錄組助力解析運動促進骨形成和免疫功能的新機制

3、J IMMUNOTHER CANCER | 單細胞測序+空間轉(zhuǎn)錄組測序助力解析新型溶瘤腺病毒發(fā)揮多種協(xié)同抗腫瘤作用機理

4、SCI ADV | 歐易單細胞測序助力解析轉(zhuǎn)錄因子c-Maf介導(dǎo)細胞代謝調(diào)控γδ T17細胞發(fā)揮效應(yīng)功能的作用機制

原創(chuàng)聲明：本文由歐易生物(OEBIOTECH)學術(shù)團隊報道，本文著作權(quán)歸文章作者所有。歡迎個人轉(zhuǎn)發(fā)及分享，未經(jīng)作者的允許禁止轉(zhuǎn)載。

標簽：