1.相關(guān)試劑

5×SDS-PAGE電泳緩沖液：Tris 15.1g，甘氨酸 94g，SDS 5g，加蒸餾水定容至1L，溶解后室溫保存，使用時(shí)稀釋為1×的工作液。

轉(zhuǎn)膜緩沖液：Tris 3.03g，甘氨酸14.42g，甲醇200ml，加蒸餾水定容至1L，4℃保存，使用前預(yù)冷。

TBST緩沖液：1mol/L Tris-HCl（PH 7.5）150ml，NaCl 135g，吐溫20 15ml，加水定容至15L，室溫保存并使用。

1M Tris-HCl（PH6.8）:Tris 121.1g，定容至1L，用濃鹽酸將PH值調(diào)至6.8。

1.5M Tris-HCl（PH8.8）：Tris 181.1g，定容至1L，用濃鹽酸將PH值調(diào)至8.8。

10%SDS：SDS 10g，加蒸餾水定容至100ml，50℃水浴下溶解，室溫保存。

10%過硫酸銨（AP）：過硫酸銨0.1g，蒸餾水定容至1.0ml，溶解后4℃保存，保存時(shí)間為1周。

2.SDS-PAGE凝膠配制

（1）使用前用蒸餾水將兩塊玻璃板沖洗干凈小心組裝好并用水檢漏。確定不漏之后將玻璃板的中的蒸餾水倒掉，并用注射器將里面的水吸干凈。

（2）下層分離膠：根據(jù)蛋白大小選取合適濃度的膠，按照配方進(jìn)行配膠。配好之后將液體混勻倒入玻璃板中（加到綠線即可，大概7.5mL），立即水封。放入烘箱中等待下層膠凝固。

（3）上層濃縮膠：待兩液相出現(xiàn)折線，膠凝后將上面的水倒出，并用注射器將水吸干凈。根據(jù)配方配置濃縮膠，配好之后混勻倒入玻璃板中（大概3mL），插入梳子之后放入烘箱中等待上層膠凝固。

（4）膠凝后將玻璃板轉(zhuǎn)過來固定于電泳槽中，加入電泳緩沖液，拔出梳子。

（5）將制備好的樣品點(diǎn)入凝膠孔，一般濃縮膠以80V電壓30min，分離膠以120V 90min。（具體時(shí)間根據(jù)實(shí)際情況而定）

3.轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)）

（1）將完成電泳的凝膠濃縮膠切掉然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡，同時(shí)濾紙也浸泡。PVDF膜放入甲醇中進(jìn)行活化30s再放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中進(jìn)行平衡10min。（0.45μm最經(jīng)典的通用轉(zhuǎn)印膜，0.22μm載量最高，適合<20KDa和低豐度蛋白的檢測(cè)）。

（2）在玻璃板上鋪海綿，七層濾紙，用玻璃棒趕走氣泡，將電泳后的膠輕放在濾紙上，貼上PVDF膜，再鋪上七層濾紙及海綿，玻璃棒趕走氣泡。將其整體轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)膜儀上。

方向應(yīng)為：陰極（黑色）-海綿-七層濾紙-膠-PVDF膜-七層濾紙-海綿-陽(yáng)極（白色）

（3）將轉(zhuǎn)膜儀中倒?jié)M轉(zhuǎn)膜液，放入冰水中，開始轉(zhuǎn)膜（根據(jù)蛋白的大小選用合適的電壓和轉(zhuǎn)膜時(shí)間）。

（4）關(guān)于轉(zhuǎn)膜電壓經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：快轉(zhuǎn)：恒壓100V，60min約可將90KDa以下的蛋白轉(zhuǎn)印過去；恒流200mA，60min約可將90KDa以下的蛋白轉(zhuǎn)印過去。

恒壓60V，3h約可將膠上所有marker轉(zhuǎn)印過去；

恒壓40V，4.5h約可將130KDa以下的蛋白轉(zhuǎn)印過去；

恒壓13V，過夜（約13h）轉(zhuǎn)膜可達(dá)到轉(zhuǎn)印效果。

注意：整個(gè)轉(zhuǎn)膜過程中在電泳槽周圍放置冰袋，防止溫度過高影響蛋白轉(zhuǎn)印效果。

方向應(yīng)為：陰極（黑色）-海綿-七層濾紙-膠-PVDF膜-七層濾紙-海綿-陽(yáng)極（白色）

4.封閉

（1）配制10%脫脂奶粉或5% BSA封閉液，充分溶解后倒入孵育盒中。

（2）用鑷子小心將膜夾出放入封閉液中，緊貼凝膠的膜面朝下放置。

（3）室溫封閉2-4h或4℃封閉過夜（室溫封閉時(shí)搖床以最慢速度搖晃）。

5.孵育一抗

（1）封閉過程完成后，將封閉液棄掉，TBST進(jìn)行洗膜，洗滌三次，每次5min，將殘余封閉液洗滌干凈。

（2）然后將膜用鑷子夾出平鋪于一抗中，室溫?fù)u晃孵育4h或4℃孵育過夜。

6．孵育二抗

（1）一抗孵育完成后，將一抗回收并用TBST洗滌3次，每次5min。

（2）提前配制好二抗，一般稀釋比例為1:4000，將膜平鋪于二抗中，室溫孵育1h（二抗注意屬性來源是否正確）。

7. 洗膜，顯影，定影

（1）將二抗棄掉，加入TBST進(jìn)行洗膜，洗滌三次，每次5min。

（2）將A、B液按1：1配制，在一試管中各加400ul的A液和B液。

（3）將濾紙吸干TBST的膜上均勻涂布配制好的顯色液，并放入成像儀中關(guān)好儀器倉(cāng)門，根據(jù)蛋白表達(dá)豐度選擇曝光時(shí)間并進(jìn)行設(shè)置。

（4）對(duì)顯色好的圖片進(jìn)行微調(diào)并保存到指定文件夾中。