小鼠CT26（Colon Tumor #26）細(xì)胞于1995年，通過將BALB/c小鼠暴露在形成快速生長的IV級癌的N-亞硝基-N-甲基氨基甲酸酯（NMU）中而開發(fā)出來的。這些細(xì)胞具有易于植入及轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。從CT26細(xì)胞系產(chǎn)生的克隆被命名為CT26.WT，本質(zhì)上有粘附的特性并具有成纖維細(xì)胞樣的形態(tài)?；蚪M，轉(zhuǎn)錄組和免疫組學(xué)研究表明CT26.WT細(xì)胞具有純合Kras突變（p.G12D）和純合缺失（Cdkn2a）。在該細(xì)胞中，增殖和干細(xì)胞標(biāo)志物（如Top2a，Birc5，Cldn6和Mki67）高度表達(dá)，而分化和top-crypt標(biāo)志物（如Muc2，Ms4a8a和Epcam）則不存在。CT26.WT細(xì)胞與侵襲性、未分化、難治性人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞有著共同的分子特征。

結(jié)直腸癌（CRC, Colorectal cancer）是男性中第三大常見癌癥，也是女性中第二大常見癌癥。結(jié)直腸癌IV期患者的5年生存率為10–14%。盡管技術(shù)在進(jìn)步，患有結(jié)直腸癌的患者的存活情況仍然相當(dāng)嚴(yán)峻。例如一些生物標(biāo)志物，RAS的突變在很大程度上限制了潛在的治療選擇。隨著新的診斷工具和治療手段的發(fā)現(xiàn)，改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后、治療方法和生活質(zhì)量的需求愈發(fā)迫切。

在過去的幾十年里，單層細(xì)胞培養(yǎng)物，如癌細(xì)胞系或永生化細(xì)胞系，已被廣泛應(yīng)用于癌癥研究。這些體外培養(yǎng)細(xì)胞是研究結(jié)腸直腸功能，疾病發(fā)展和治療干預(yù)的重要工具。CT26.WT細(xì)胞是常見的細(xì)胞模型之一，也是生命科學(xué)家的工具。生命科學(xué)家們致力于研究疾病或治療活性藥物分子的作用機(jī)制，以及破譯細(xì)胞信號事件，如DNA損傷修復(fù)。迄今為止，已在500多個(gè)科學(xué)出版物對CT26.WT細(xì)胞進(jìn)行了描述。

應(yīng)用：

CT26.WT在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中有著廣泛應(yīng)用

1.?癌癥疫苗：用于治療性癌癥疫苗或預(yù)防性癌癥疫苗的轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞的研究。

2.?基因發(fā)現(xiàn)：識別新的癌癥驅(qū)動(dòng)基因并發(fā)現(xiàn)癌癥特異性脆弱性。

3.?癌癥復(fù)發(fā)：確定癌癥復(fù)發(fā)相關(guān)基因，相互作用網(wǎng)絡(luò)，下游研究和對腫瘤復(fù)發(fā)的預(yù)防措施。

4.?新藥：新的治療突破點(diǎn)和發(fā)展更有效的治療方案。

5.?疾病建模：同種異體移植和異種移植建模。

6.?植物藥：植物提取物對腫瘤生長，轉(zhuǎn)移，細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡的影響。

7.?溶瘤研究：病毒信息，遺傳修飾和/或轉(zhuǎn)基因表達(dá)的存在，靶向癌癥類型，策略和安全性。

CRISPR-U? 在CT26.WT細(xì)胞中的基因編輯

基因編輯是指基因的插入，刪除或替換成別的基因。CRISPR系統(tǒng)用于精確的基因組編輯，并且可以通過用目的供體序列替換靶基因序列來進(jìn)行基因敲除或敲入的基因編輯操作。CT26.WT細(xì)胞是侵襲性鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系，在該細(xì)胞系內(nèi)進(jìn)行基因編輯可以生成單個(gè)或多個(gè)基因敲除，突變校正或插入報(bào)告基因轉(zhuǎn)基因。而這些基因組編輯的細(xì)胞系將幫助到研究人員研究癌癥標(biāo)志，揭示藥物抗性機(jī)制，癌癥治療，細(xì)胞死亡研究，功能基因組學(xué)，信號傳導(dǎo)途徑，藥物發(fā)現(xiàn)，藥物反應(yīng)和細(xì)胞療法。

CRISPR/Cas9技術(shù)積極推動(dòng)結(jié)腸癌相關(guān)的體內(nèi)和體外基因編輯的進(jìn)展，并對分子醫(yī)學(xué)有著重大影響。源井生物開發(fā)的CRISPR-U?可用于CT26.WT細(xì)胞系進(jìn)行基因操作。因此，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在CT26.WT細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因組編輯。源井生物提供定制的真核CT26.WT細(xì)胞的基因編輯，及在動(dòng)物模型中生成各種基因修飾。

案例分析：

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的敲除細(xì)胞系揭示了自噬破壞在免疫反應(yīng)性腫瘤上的影響

自噬在癌癥中的作用是復(fù)雜的，依賴于背景的，且有時(shí)又是矛盾的，因?yàn)樗呀?jīng)表現(xiàn)出對腫瘤進(jìn)展有著抑制，或促進(jìn)，或不關(guān)聯(lián)的作用。自噬的促存活功能可被癌細(xì)胞控制，以在代謝應(yīng)激條件下實(shí)現(xiàn)快速增殖，而這通常會在腫瘤微環(huán)境中觀察到。在這項(xiàng)研究中，研究人員通過消耗小鼠腫瘤細(xì)胞中的自噬相關(guān)7（ATG7）并將它們移植到具有免疫活性的與具有免疫缺陷的宿主中，來評估免疫系統(tǒng)對腫瘤對自噬的依賴性的影響。他們發(fā)現(xiàn)ATG7的缺失并不影響體外或在免疫缺陷小鼠中的腫瘤生長。癌細(xì)胞對自噬的依賴受到抗腫瘤免疫應(yīng)答的影響，也包括那些由CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答。

研究人員使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)從小鼠黑素瘤細(xì)胞系B16F10，小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞MC38和小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞系CT26中敲除ATG7，以研究自噬在小鼠癌細(xì)胞增殖中的作用。他們檢測了ATG7的功能喪失和自噬對ATG5，LC3和p62的影響（圖1A）。所有ATG7缺陷型細(xì)胞系均具有明顯的生存劣勢（圖1B-D）。在營養(yǎng)豐富的條件下，ATG7KO細(xì)胞系的增殖表明ATG7在體外不會影響B(tài)16F10，MC38或CT26細(xì)胞的增殖（圖1E-G）。

為了確定自噬可以在體內(nèi)支持鼠癌細(xì)胞致瘤性，研究人員將對照組（Ctrl）和ATG7-KO細(xì)胞系移植到免疫缺陷小鼠中。數(shù)據(jù)表明ATG7的缺失不會影響B(tài)16F10腫瘤（在裸鼠中），MC38或CT26腫瘤（在NSG小鼠中）的生長（圖2a-c）。植入到免疫活性（C57BL/6或BALB/c）小鼠品系中的B16F10，MC38或CT26細(xì)胞系的體內(nèi)腫瘤生長情況如圖2d-f所示。表達(dá)載體對照（+Vec）或植入ATG7（+ATG7）的BALB/c小鼠中的CT26腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤生長情況如圖2g所示。

為了分析同基因模型中免疫浸潤的水平，研究人員利用免疫組織化學(xué)（IHC）去檢測和定量從免疫活性宿主分離的B16F10，MC38和CT26腫瘤內(nèi)的CD3+和CD8+細(xì)胞（圖3a-b）。植入到BALB/c小鼠中的Ctrl或ATG7KO的CT26細(xì)胞經(jīng)IgG，抗CD8或抗CD4抗體處理的數(shù)據(jù)如圖3c-f所示。

為什么在免疫活性（BALB/c）或免疫缺陷（NSG）小鼠中，在ATG7-感受態(tài)或ATG7-缺陷型CT26細(xì)胞上進(jìn)行的自噬破壞在免疫活性環(huán)境中會產(chǎn)生更明顯的影響呢？在NSG小鼠中的腫瘤，與自噬成熟型腫瘤相比，腫瘤中ATG7的缺失導(dǎo)致12個(gè)基因的顯著上調(diào)，以及3個(gè)基因的顯著下調(diào)（圖4a）。受自噬破壞影響的途徑如圖4b所示。通過Gzma和Prf1表達(dá)的對數(shù)平均值進(jìn)行定義（圖4c），自噬缺陷型腫瘤具有更高的細(xì)胞溶解活性評分。

綜上所示，自噬缺陷型腫瘤有著大量具有調(diào)節(jié)腫瘤殺傷潛力的細(xì)胞，例如細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞或NK細(xì)胞。免疫相關(guān)基因的富集表明破壞癌細(xì)胞自噬可以促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境的聚集，也有可能會增強(qiáng)活性，從而導(dǎo)致腫瘤負(fù)荷降低。

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Reference::

Anti-tumor immunity influences cancer cell reliance upon ATG7. ONCOIMMUNOLOGY.2020, VOL. 9, NO. 1, e1800162.

作者 | Dr. ASAD UZZAMAN

注明 | 文章是源井生物原創(chuàng)，轉(zhuǎn)載請注明。