癌癥相關(guān)成纖維細胞 (CAF)是腫瘤微環(huán)境（TME）最豐富的基質(zhì)細胞之一，在腫瘤細胞侵襲，腫瘤干細胞更新，化療耐藥和免疫細胞逃避過程中發(fā)揮重要作用，是腫瘤治療的重要靶標。但CAF是個異質(zhì)細胞群，為了確保精確靶向腫瘤的 CAF，我們需要通過識別特定標記更好地表征 CAF 異質(zhì)性。單細胞測序無疑是表征腫瘤異質(zhì)性的好方法，但測序樣本要求比較高，費用較高也讓一些研究者望而卻步。那有什么替代方法嗎？當(dāng)然有，本次就給大家推薦一個利用單細胞公共數(shù)據(jù)的純生信發(fā)文思路，站在巨人的肩膀上輕松發(fā)文10分+！

文章題目：Implication of cancer associated fibroblast subtypes on cancer pathogenesis, prognosis, and immunotherapy resistance（癌癥相關(guān)成纖維細胞亞型對癌癥發(fā)病機制、預(yù)后和免疫治療耐藥的影響）

研究背景

CAFs可以促進腫瘤細胞侵襲，腫瘤干細胞特性，化療耐藥和免疫細胞逃避等；然而，在某些癌癥類型中，CAFs 還可以在 TME 中發(fā)揮腫瘤抑制作用。為了確保精確靶向促進腫瘤的 CAF，我們需要通過識別特定標記更好地表征 CAF 異質(zhì)性。單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 已經(jīng)揭示了一系列癌癥類型的惡性和/或基質(zhì)細胞異質(zhì)性，但是不同癌癥類型的 CAF 子集是否以及如何共享相似的基因表達譜和分子功能尚不清楚，CAF 亞型的臨床關(guān)聯(lián)及其與免疫療法耐藥性的關(guān)系仍有待確定。因此，作者對來自黑色素瘤 (MEL)、頭頸部鱗狀細胞癌 (HNSC) 和肺癌 (LC) 的 CAF 進行了綜合分析，并確定了在每個 CAF 亞型中明顯活躍的分子特征。鑒定了個體 CAF 亞型的基因特征，并用于研究亞型豐度與臨床結(jié)果和免疫治療耐藥性的關(guān)聯(lián)。

研究流程

主要結(jié)果

1. Pan-CAF亞型的鑒定和分子表征

綜合數(shù)據(jù)的高分辨率聚類確定了七個 CAF 亞型（圖2A)，稱為Pan-CAF 1-7。這些泛CAF亞型存在于三種癌癥類型中，但豐度不同（圖2B)。

>??Pan-CAF 1 由 1007 個細胞組成（占所有 CAF 的 53.8%，紅色），并根據(jù)激活的成纖維細胞標志物 ( ACTA2 ) 和平滑肌細胞標志物 ( MYH11、MCAM、TAGLN和MYLK ) 的表達升高被歸類為Pan-myCAF，GO 分析顯示與平滑肌收縮和血管傷口愈合相關(guān)的基因集富集；

>??Pan-CAF 2 包含 815 個細胞（28.3%，棕色）并根據(jù)編碼膠原蛋白的基因（COL1A1、COL3A1等），和GO分析中與細胞外基質(zhì) (ECM) 重塑的相關(guān)的基因富集而被歸類為Pan-dCAF

>??Pan-CAF 3 由 588 個細胞（20.5%，深綠色）組成，基于CFD、C3、CXCL14和CXCL12 的高表達和GO分析富集于炎癥，被表征為 pan-iCAF；

>??Pan-CAF 4，包含 202 個細胞（7.0%，淺綠色）被歸類為 pan-iCAFs-2，具有高且獨特的炎癥相關(guān)基因表達，包括CXCL2。GO 分析發(fā)現(xiàn)基因在 NF-kB 信號通路富集；

>??Pan-CAF 5 包含 158 個細胞（5.5%，藍色），因為其體內(nèi)平衡標記基因的富集，被歸類為正常成纖維細胞（pan-nCAF）；

>?Pan-CAF 6 由 69 個細胞 (2.4%) 組成，代表低質(zhì)量細胞簇 (LQ-CAF)，沒有可檢測的標記基因，因此被排除在進一步分析之外；

>?Pan-CAF 7，由 34 個細胞 （1.2%, 粉紅色），由于與細胞周期相關(guān)的基因（BIRC5、TOP2A等）表達升高，以及與細胞增殖相關(guān)基因的富集，而被歸類為 pan-pCAF 。Seurat 的細胞周期分析還表明，該簇富含與細胞周期 S 期相關(guān)的基因（圖2E）。

進一步注釋 pan-CAF 的表型和功能異質(zhì)性，分析表明，pan-myCAFs 表達一組不同的膠原蛋白（COL4A1、COL4A2等）、參與血管生成的基因（EGFL6、ANGPT2和PDGFA）、平滑肌相關(guān)的收縮基因和 RAS 超家族成員。Pan-dCAFs 表達一組不同的膠原蛋白（COL1A1、COL7A1、COL10A1等）、MMP、TGFB 信號分子和 ECM 相關(guān)基因。pan-iCAFs和pan-iCAFs-2的膠原基因表達低，但促炎分子表達高。具體而言，pan-iCAFs 高表達促炎和免疫抑制因子 IL-33、CXCL12 和 CXCL14，而 pan-iCAFs-2 高表達 CXCL1-3、CCL2、IL-6 和 IL-7（圖2F）。這些結(jié)果突出了 pan-CAF 亞型之間的相似性和差異，以及每種 CAF 亞型可能產(chǎn)生的相關(guān)細胞因子和免疫因子，用于介導(dǎo)其與其他 TME 或腫瘤細胞的特定相互作用。

最后，為了為未來pan-CAF 亞型的實驗鑒定和分離提供一個框架，作者使用細胞表面蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫鑒定了在細胞膜表面產(chǎn)生蛋白質(zhì)的標記基因（圖 2G）。

2. Pan-CAF 亞型特異性轉(zhuǎn)錄因子和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

作者接下來確定轉(zhuǎn)錄因子 (TF) 及其靶向基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以便更好地了解Pan-CAF 亞型是如何在遺傳上建立和維持的。為此，應(yīng)用軟件 SCENIC 來識別在一種Pan-CAF 亞型與其他亞型中高度活躍的 TF 及其靶基因（圖3）。

Pan-myCAF 富含MEF2C，調(diào)節(jié)新血管生成，MEF2C 的靶基因如MYLK、ACTA2等在 pan-myCAFs 中均上調(diào)（圖3A, B）；

TWIST1是 pan-dCAF 中表達最高的 TF 之一，它是 CAF 轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵因素。此外，TWIST1 的靶基因（TWIST2、COL1A1、MMP2等）在 pan-dCAF 中均上調(diào)（圖3A, C）；

Pan-iCAFs和Pan-iCAFs-2顯示出高表達NR1H3，可以控制與炎癥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄程序。NR1H3 的靶基因（IL-33、CXCL14、CXCL12等）在 pan-iCAF 中均上調(diào)。除了NR1H3，pan-iCAFs-2 還顯示出NF-kB亞基RELB 的高表達，這是一種已知的參與促進炎癥轉(zhuǎn)錄程序的輔助因子。此外，RELB 目標促炎基因（CXCL2、TNFAIP3等）在 Pan-iCAFs-2 中上調(diào)（圖3A, D, E）；

Pan-pCAF 顯示出FOXM1 的高表達，這與細胞增殖有關(guān) ，已知的FOXM1循環(huán)調(diào)控靶基因（BIRC5、CDK1等）在 pan-pCAFs 中上調(diào)（圖3A, F）。

3. Pan-CAF亞型特異性基因特征預(yù)后效用的泛癌評估

作者試圖評估癌癥類型和起源組織如何影響腫瘤的 CAF 亞型以及已識別的Pan-CAF 亞型的促腫瘤發(fā)生和抗腫瘤發(fā)生特性。為了解決這個問題，作者策劃了Pan-CAF 亞型特異性基因特征，并使用它們來評估TCGA 中獲得的 31 種癌癥類型的Pan-CAF 豐度，并以特征基因的更高表達代表Pan-CAF 亞型的高豐度，以此特征評估Pan-CAF 亞型的預(yù)后效用。

結(jié)果顯示，pan-myCAFs 特征基因的高表達與膀胱尿路上皮癌 (BLCA) 的不良預(yù)后相關(guān)，表明 pan-myCAFs 可能在 BLCA TME 中具有促腫瘤作用（圖4A）。pan-dCAF基因特征的高表達與胃腺癌（STAD）、腎透明細胞癌 (KIRC)的不良預(yù)后相關(guān)（圖4B, C），pan-iCAFs 特征基因的高表達與 LGG 的不良預(yù)后相關(guān)。iCAFs-2 基因的高表達與 LGG 的不良預(yù)后相關(guān)（圖4D），與皮膚黑色素瘤（SKCM）的良好臨床結(jié)果相關(guān)（圖4E）。pan-pCAF 基因的高表達與包括 MESO 在內(nèi)的幾種癌癥類型的不良預(yù)后相關(guān)（圖4F）。

單個pan-CAF 基因特征的風(fēng)險比 (HR) 的分層聚類表明 TCGA 腫瘤可分為三組。第一組由大多數(shù)pan-CAF 亞型與不良預(yù)后密切相關(guān)的腫瘤類型組成：MESO、腎上腺皮質(zhì)癌 (ACC)、KICH等；第二組由大多數(shù) pan-CAF 亞型與預(yù)后中度至無關(guān)的腫瘤類型組成：子宮癌肉瘤 (UCS)、食管癌 (ESCA)、 結(jié)腸腺癌 (COAD), 肺鱗狀細胞癌 (LUSC), 直腸腺癌 (READ), 肺腺癌 (LUAD等；最后一組由大多數(shù)pan-CAF亞型與良好預(yù)后相關(guān)的腫瘤類型組成：前列腺腺癌（PRAD）和嗜鉻細胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（PCPG）（圖4G）。

這些結(jié)果表明癌癥類型和起源組織如何塑造 CAF 亞型，并提供洞察哪些pan-CAF 亞型可能有助于特定癌癥類型的腫瘤促進或腫瘤抑制作用。

4. Pan-CAF亞型與腫瘤中特定分子功能的關(guān)聯(lián)

由于觀察到單個Pan-CAF 亞型與特定癌癥類型的不良預(yù)后相關(guān)，因此作者試圖確定在Pan-CAF 亞型豐度更高的腫瘤中失調(diào)的分子途徑。應(yīng)用了排序基因集富集分析（rGSEA）Pan-CAF亞型與預(yù)后不良或預(yù)后顯著相關(guān)的癌癥類型。

結(jié)果顯示，這五種Pan-CAF 亞型豐度增加的腫瘤顯示出與免疫細胞激活、ECM 和膠原蛋白相關(guān)的活性基因集（節(jié)點）的顯著富集，表明 CAF 可能具有共同的功能。與具有高比例 pan-iCAF、pan-iCAF-2 或 pan-pCAF 的腫瘤相比，具有高比例 pan-myCAF 的腫瘤表現(xiàn)出最多數(shù)量的與平滑肌細胞收縮相關(guān)的基因集（圖5A）。與 pan-myCAF、pan-dCAF 和 pan-pCAF 比例高的腫瘤相比，pan-iCAF 比例高的腫瘤顯示出與白細胞介素信號相關(guān)的基因組數(shù)量增加，表明Pan-iCAF 可能與更具炎癥性的分子微環(huán)境有關(guān)（圖5C, D）。pan-dCAFs和pan-pCAFs比例增加的癌癥顯示出與細胞周期相關(guān)的正富集基因集，表明pan-dCAF和pan-pCAFs比例高的腫瘤與細胞周期增強的分子微環(huán)境相關(guān)（圖5B, E）。

綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，不同的pan-CAF 亞型存在TME 中，它們可能提供有利或不利的環(huán)境，通過激活或抑制特定基因通路來促進或阻礙各種癌癥類型的腫瘤發(fā)展。

5. Pan-CAF亞型與抗 PD1 和抗 PD-L1 治療耐藥的關(guān)聯(lián)

靶向PD-L1 或PD-1的治療性抗體可以在診斷為轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的患者中引起強烈而持久的反應(yīng)。由于作者觀察到特定的 pan-CAF 亞型表達免疫抑制炎癥因子（例如，CXCL12、CXCL14），因此進一步利用抗PD-L1治療的轉(zhuǎn)移性尿路上皮腫瘤和用抗PD-1處理的轉(zhuǎn)移性黑素瘤的公共數(shù)據(jù)集研究了 pan-CAF 亞型是否與免疫靶向治療的有效性相關(guān)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在接受抗 PD-L1 治療后出現(xiàn) PD 的轉(zhuǎn)移性膀胱癌患者中，與 pan-myCAF、pan-dCAF、pan-iCAF 和 pan-pCAF 相關(guān)的基因集呈陽性且顯著富集（圖6A）。接受抗 PD-1 治療時經(jīng)歷 PD 的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中，與 pan-myCAF、pan-dCAF、pan-iCAF、pan-pCAF 和 pan-iCAF-2 相關(guān)的基因集呈陽性且顯著富集（圖6B）。在被診斷為轉(zhuǎn)移性腎癌且在接受抗 PD-L1 治療時發(fā)生 PD 的患者中觀察到與 pan-dCAF 相關(guān)的基因集的陽性和顯著富集（圖6C）。

總的來說，這些結(jié)果表明，特定的pan-CAF 可能與轉(zhuǎn)移性膀胱癌、黑色素瘤和腎癌中的 ICB 耐藥相關(guān)。

文章小結(jié)

結(jié)語

本次的文獻分享和思路解析就分析到這里了，對腫瘤耐藥和免疫感興趣又想做純生信文章的小伙伴可以跟著文章的思路，換一種異質(zhì)性細胞或者換一些腫瘤類型就可以復(fù)現(xiàn)啦！另外，對腫瘤耐藥感興趣的小伙伴也可以參看我們公告欄里的相關(guān)后續(xù)信息：腫瘤耐藥+國自然熱點思路為您高分文章的發(fā)表和基金課題的申請助力！

參考文獻

Galbo PM Jr, Zang X, Zheng D. Molecular Features of Cancer-associated Fibroblast Subtypes and their Implication on Cancer Pathogenesis, Prognosis, and Immunotherapy Resistance. Clin Cancer Res. 2021;27(9):2636-2647. doi:10.1158/1078-0432.CCR-20-4226