基因過表達(dá)的新青年—CRISPRa

? ? ? ?上回說到，基因功能研究，最常用的策略就是功能獲得和功能失活?；蜻^表達(dá)、基因干擾、基因敲除，這三板斧揮出去，配合下游的轉(zhuǎn)錄譜分析、表型分析，基因功能的神秘面紗，往往就能解開一角。

? ? ? ?基因過表達(dá)技術(shù)，通常是指將目的基因的ORF構(gòu)建到組成型啟動子或組織特異性啟動子的下游，通過載體轉(zhuǎn)入某一特定細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)量增加的目的，可以使用的載體類型有Virus-Free轉(zhuǎn)座子載體，慢病毒載體，腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體等多種類型。當(dāng)基因表達(dá)產(chǎn)物超過正常水平時，觀察該細(xì)胞的生物學(xué)行為變化，從而了解該基因的功能。

? ? ? ?CRISPRa(轉(zhuǎn)錄激活)，作為基因過表達(dá)技術(shù)的新成員，是通過催化失活的Cas9（dCas9）連上轉(zhuǎn)錄激活子，來實(shí)現(xiàn)促進(jìn)基因組特定位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄。

? ? ? ?目前CRISPRa已經(jīng)發(fā)展出好幾個新版本。MIT的CRISPR先驅(qū)張鋒通過改造dCas9和sgRNA優(yōu)化了轉(zhuǎn)錄機(jī)器的招募，成功將RNA表達(dá)水平提升了一個數(shù)量級。張鋒團(tuán)隊(duì)用自己的改良版CRISPRa激活了十個基因,研究顯示，這些基因的轉(zhuǎn)錄都得到了兩倍以上的增漲，許多基因的活性甚至有了幾個數(shù)量級的增加。他們發(fā)現(xiàn)，CRISPRa離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)越近，轉(zhuǎn)錄激活的效果就越強(qiáng)。如果CRISPRa靶向轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游（超過200bp），觸發(fā)的轉(zhuǎn)錄就會更為溫和，更接近生理水平。通過這一途徑揭示了基因表達(dá)量與表型強(qiáng)度之間的線性關(guān)系。

? ? ? ?加州大學(xué)的Jonathan Weissman研究團(tuán)隊(duì)在dCas9上融合了一連串短肽（也就是SunTag array），這些短肽相當(dāng)于一套分子掛鉤，能在細(xì)胞中招募多拷貝的轉(zhuǎn)錄激活子，生成強(qiáng)勁的信號。

? ? ? ?綜合看CRISPRa（基因激活）系統(tǒng)是用于轉(zhuǎn)錄激活內(nèi)源性基因的強(qiáng)大工具。完整的CRISPRa系統(tǒng)包含三個組分，每個組分分別由單獨(dú)的載體提供：gRNA/MS2表達(dá)載體，MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64輔助載體。

? ? ? ?gRNA/MS2表達(dá)載體，包括兩個138-nt發(fā)夾RNA適體，形成噬菌體MS2衣殼蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。這些發(fā)夾RNA適體與gRNA連接，有利于高效募集MS2-融合蛋白。

? ? ? ?MS2/P65/HSF1輔助載體驅(qū)動由MS2，p65（NF-kB的反式激活亞基）和HSF1（人熱休克因子1的激活結(jié)構(gòu)域）組成的三結(jié)構(gòu)域融合蛋白的表達(dá)。

? ? ? ?dCas9/VP64輔助載體驅(qū)動催化失活變體dCas9和合成型VP64反式激活結(jié)構(gòu)域融合蛋白的表達(dá)。

? ? ? ?當(dāng)這三種載體共轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞時，用戶定制的gRNA可能會募集MS2/P65/HSF1（通過MS2結(jié)合發(fā)夾適體與gRNA連接）和dCas9/VP64（通過CRISPR/Cas9復(fù)合物組裝） 到gRNA靶位點(diǎn)，從而組裝出強(qiáng)大的SAM復(fù)合物。這些SAM復(fù)合物可通過VP64，p65和HSF1激活結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)的強(qiáng)烈轉(zhuǎn)錄激活。

? ? ? ?該載體系統(tǒng)可用于激活單個或一系列基因的轉(zhuǎn)錄，也可用于基因組的大規(guī)模篩選，使用gRNA序列文庫來產(chǎn)生gRNA/MS2表達(dá)載體文庫。?

Chavez A, et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming[J]. Nature Methods, 2015, 12(4): 326-328.??

J Microbiol Biotechnol. 2017 Oct 28;27(10):1855-1866. doi:?10.4014/jmb.1705.05081.

CRISPRa vs ORF傳統(tǒng)過表達(dá)技術(shù)

? ? ? ?相比于傳統(tǒng)ORF穩(wěn)轉(zhuǎn)過表達(dá)技術(shù)，CRISPRa通過激活內(nèi)源性啟動子高效轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)基因表達(dá)，不需要額外構(gòu)建外源性表達(dá)元件，不受基因轉(zhuǎn)錄本大小的限制。

Kampmann M. (2018). CRISPRi and CRISPRa Screens in Mammalian Cells for Precision Biology and Medicine. ACS chemical biology, 13(2), 406–416.

? ? ? ?因此，CRISPRa技術(shù)在長轉(zhuǎn)錄本基因過表達(dá)研究、單基因多轉(zhuǎn)錄本的整體激活研究具有不可替代的優(yōu)勢。

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作者：海星生物?

公眾號：Cas9X細(xì)胞基因編輯

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