1.細(xì)胞背景與應(yīng)用現(xiàn)狀

1.1 細(xì)胞背景：

HCT116細(xì)胞是由M·Brattain等人于1979年從一位患結(jié)直腸癌的48歲男性病人中分離得到的。該細(xì)胞在半固體瓊脂糖培養(yǎng)基中形成克隆，在無胸腺裸鼠中有致瘤性，形成上皮樣的腫瘤，屬于上皮樣貼壁生長的腫瘤細(xì)胞系。

1.2 應(yīng)用范圍和前景：

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤中發(fā)病率位居第三，死亡率位居第二，根據(jù) GLOBOCAN 數(shù)據(jù)顯示，2018 年全球結(jié)直腸癌新增 185 萬例，約 88 萬人死亡，給人類健康帶來了巨大威脅。[1]因此，研究結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制以及治療手段對臨床診斷和治療結(jié)直腸癌具有十分重要的意義。目前，在藥物開發(fā)的最初級階段即細(xì)胞生物學(xué)水平的鑒定中，HCT166細(xì)胞已成為結(jié)直腸癌研究領(lǐng)域中被廣泛使用的模式細(xì)胞，具體應(yīng)用舉例如下：

（1） 探究藥物影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲的機(jī)制。例如：PPARα在白霉素處理的HCT116細(xì)胞遷移活性及CYP2S1和CYP1B1的表達(dá)中起重要作用[2]

（2） 探究藥物影響結(jié)直腸癌細(xì)胞生長的體外作用機(jī)制，如細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期改變等。例如：Raddeanin A通過PI3K/AKT通路調(diào)控人HCT116細(xì)胞凋亡和周期阻滯[3]

（3） 探究藥物對結(jié)直腸癌治療的敏感性和耐藥性。例如：Doxorubicin抑制HCT116細(xì)胞中miR-140的表達(dá)而上調(diào)PD-L1，從而使腫瘤細(xì)胞對藥物產(chǎn)生耐藥性[4]

（4） 開發(fā)新的癌相關(guān)信號通路，為臨床治療結(jié)直腸癌提供指導(dǎo)：例如，研究Notch和Wnt信號通路在結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116耐藥中的意義等[5]

（5） 開發(fā)LncRNA和miRNA在結(jié)直腸癌治療中的新途徑。例如：在HCT116細(xì)胞中，YWHAE長鏈非編碼RNA通過激活K-Ras/Erk1/2和PI3K/Akt信號通路與miR-323a-3p和miR-532-5p競爭，為結(jié)直腸癌的治療提供新的靶位點(diǎn)[6]

2.CRISPR/Cas9技術(shù)在HCT116細(xì)胞中的應(yīng)用

如上所述，HCT116細(xì)胞在結(jié)腸癌的各種機(jī)制都具有重要的研究價(jià)值，而最基本的研究思路一般都從分子層面即基因或蛋白開始，因此CRISPR/Cas9技術(shù)的身影也就理所當(dāng)然地出現(xiàn)在許多研究課題中，畢竟它在研究致癌相關(guān)的單基因功能中有著無可替代的優(yōu)勢。

如發(fā)現(xiàn)TRPM4在人結(jié)直腸癌中高表達(dá)，似乎與結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期和侵襲有關(guān)，通過在HCT116細(xì)胞中利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除TRPM4后發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲的確都降低了，同時(shí)伴隨著細(xì)胞周期的改變[7]； 以及Cell報(bào)道利用CRISPR/Cas9技術(shù)，將野生型KRAS替換為突變型使得雜合突變的HCT116細(xì)胞對藥物治療更為敏感[8]； 再如利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除HCT116細(xì)胞中的Tks4基因，表現(xiàn)出顯著的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)增加，細(xì)胞間的粘附程度降低，發(fā)現(xiàn)Tks4基因在EMT調(diào)控和腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9]； 發(fā)現(xiàn)CTC1L1142H突變導(dǎo)致端粒酶維持受損，研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)突變HCT116細(xì)胞中的CTC1，證實(shí)了CTC1:STN1相互作用為抑制端粒酶活性所必需[10]。

可以看出，研究人員對于CRISPR/Cas9技術(shù)的青睞是毋庸置疑的，源井生物提供的CRISPR/Cas9技術(shù)服務(wù)也為眾多科研人員解決了實(shí)驗(yàn)難題，如細(xì)胞敲除不徹底、細(xì)胞敲入不穩(wěn)定等等，讓更多科研人員能順利實(shí)現(xiàn)他們的科研目標(biāo)。

3. 案例分析

3.1 基因點(diǎn)突變[11]

Hiroyuki Kato等研究者利用CRISPR/Cas9技術(shù)在HCT116細(xì)胞中突變了UTX基因第137和138位氨基酸：G137V和 G137VΔ138，發(fā)現(xiàn)原本表達(dá)于細(xì)胞核的野生型UTX，在兩種突變株的細(xì)胞核中表達(dá)量大大降低了，而在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)增加了，如圖A-C所示：A,B為免疫熒光圖片，C為Western Blot結(jié)果；免疫共沉淀的結(jié)果如圖D所示，這是一種新的UTX調(diào)控機(jī)制，文章中還進(jìn)一步揭示了UTX與MLL3/4復(fù)合物（ASH2L, PTIP and PA1是MLL3/4復(fù)合物的成分）相互作用在癌癥形成中的重要性。

3.2 基因敲除[12]

Sara Steinmann等人利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得了DAPK1缺失型的HCT116單克隆細(xì)胞系，最終揭示了DAPK1對結(jié)直腸癌侵襲性的影響。

經(jīng)過Western Blot驗(yàn)證，Sara Steinmann等人得到了三種DAPK1基因敲除型單克隆細(xì)胞（如圖A所示）。免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測pERK1/2主要位于野生型HCT116細(xì)胞質(zhì)，然而在三種敲除型細(xì)胞中，pERK1/2均在細(xì)胞核中顯著表達(dá)。（如圖B所示）

由于絨毛膜尿囊膜模型（CAM）實(shí)驗(yàn)是血管生成的經(jīng)典體內(nèi)模型，研究人員將DAPK1敲除型克隆和野生型HCT116細(xì)胞移植到雞CAM上，并在蛋中培養(yǎng)5天，發(fā)現(xiàn)DAPK1的缺失導(dǎo)致CAM體內(nèi)生長模式的改變和腫瘤出芽的增強(qiáng)(如圖C所示)

此外，該研究團(tuán)隊(duì)利用大鼠腦3D體外模型發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在雞胚胎器官中有更多的擴(kuò)散，并且侵襲能力也增強(qiáng)了。DAPK缺失型HCT116細(xì)胞表現(xiàn)出更多的彌散性腫瘤細(xì)胞，并優(yōu)先在雞胚的肝、心、腦中積累（如圖D所示）。最后，研究人員發(fā)現(xiàn)DAPK1-ERK1信號通路參與了CRC的轉(zhuǎn)移過程(如圖E所示)。

3.3 基因敲入[13]

Bax是促凋亡Bcl-2基因家族成員之一，在線粒體依賴的凋亡起始中發(fā)揮重要作用，R Peng等研究人員在BAX-KO HCT116細(xì)胞中敲入了5種位于Bax基因上且與Bcl-2其它成員有相互作用的突變位點(diǎn)。

已有文獻(xiàn)報(bào)道BAX-KO HCT116細(xì)胞在一種甾醇類藥物 sulindac的刺激下并不會(huì)發(fā)生凋亡，而R Peng等研究人員發(fā)現(xiàn)在BAX-KO HCT116細(xì)胞中敲入WT BAX能恢復(fù)sulindac和TRAIL引起的HCT116細(xì)胞凋亡；敲入K21E和D33A突變，Bax介導(dǎo)的凋亡被完全恢； 敲入D68R和 S184V突變只恢復(fù)了一部分，而敲入L70A/D71A突變恢復(fù)藥物引起的凋亡程度更低。

該研究是在敲除目的細(xì)胞中的目的基因的基礎(chǔ)上，再敲入含有突變位點(diǎn)的目的基因以及WT目的基因（作為對照），便可清晰地了解目的基因表達(dá)的蛋白和與之相互作用的其它蛋白間相互作用的特定位點(diǎn)關(guān)系，是一個(gè)驗(yàn)證通過生物信息學(xué)分析得到的預(yù)測位點(diǎn)是否在蛋白質(zhì)相互作用中真實(shí)起作用的好方法。因此，源井生物也為科研人員提供了相應(yīng)的服務(wù)便利，在享受細(xì)胞敲入服務(wù)的同時(shí)，還會(huì)得到我們贈(zèng)送的敲除細(xì)胞，滿足科研人員的各種研究需求。

源井生物的獨(dú)家專利技術(shù)CRISPR-UTM以及5000多例成功案例經(jīng)驗(yàn)，讓我們的基因編輯服務(wù)更有保障。