基本信息

期刊：Nature communications

影響因子：17.694

發(fā)表年月：2022年11月

材料：MB49細胞，C57BL/ 6J（batf3 KO）雄性小鼠，C57BL/ 6雄性小鼠，NTPDase抑制劑多氧鎢酸鈉（POM-1/CD39i)，單克隆抗小鼠NK1.1抗體，單克隆抗小鼠PD-1（CD279）抗體，CIS，0.5%CMC‐Na或PBS

方法：10x Genomics高通量單細胞轉錄組測序

研究背景

膀胱癌(BC)是指發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，世界范圍內(nèi)，膀胱癌發(fā)病率位居惡性腫瘤的第 9 位。近幾十年來，局部腫瘤切除聯(lián)合膀胱內(nèi)BCG免疫治療一直是NMIBC的一線治療方法，但總體治療效果一直不理想，仍有相當比例的患者疾病會復發(fā)。而基于CIS的化療聯(lián)合根治性膀胱切除術作為MIBC和晚期BC的治療方案也并不令人滿意。免疫檢查點抑制劑是解決以上方案缺陷的一種新的治療策略，已有幾種PD-1抑制劑和PD-L1抑制劑被批準用于治療MIBC，但該方案客觀緩解率僅為13–25%，因此，迫切需要開發(fā)新的BC治療靶點或聯(lián)合治療策略。

腫瘤微環(huán)境(TME)是潛在的BC治療靶點，作者所在的團隊之前通過對8個BC腫瘤樣本和3個BC腫瘤樣本進行單細胞RNA測序，揭示了腫瘤內(nèi)部存在的高度異質(zhì)性?；趯?shù)據(jù)的進一步挖掘，發(fā)現(xiàn)腫瘤來源的淋巴細胞中免疫檢查點數(shù)量顯著增加，進一步分析發(fā)現(xiàn)在這些免疫檢查點中，CD39與膀胱癌進展顯著相關。本研究旨在利用單細胞測序深入探究CD39在膀胱癌發(fā)展過程中的相關性，后續(xù)采用不同的治療手段進一步驗證CD39i應用在臨床治療上的可行性，為臨床中膀胱癌的有效免疫治療提供新思路。

研究結果

Result1 CD39在膀胱癌細胞BC中過表達，主要定位于腫瘤間質(zhì)區(qū)，其表達水平與T細胞衰竭呈正相關

作者對之前發(fā)表的數(shù)據(jù)(來自BC患者的8個腫瘤樣本和3個腫瘤旁樣本)進一步挖掘，發(fā)現(xiàn)腫瘤來源的淋巴細胞中免疫檢查點數(shù)量顯著增加，進一步分析發(fā)現(xiàn)在這些免疫檢查點中，CD39與膀胱癌進展顯著相關(附圖1B)。

8個BC和3個癌旁樣本中的所有細胞通過tSNE降維聚類和經(jīng)典的marker標記，被鑒定成10個主要的細胞類型，包括：上皮細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和周細胞、成纖維細胞、髓樣細胞、B細胞、 T和NK細胞、肥大細胞、LYVE1 +細胞和漿細胞（圖1A)。進一步探究CD39的分布，CD39主要表達于內(nèi)皮細胞、SMC和周圍髓細胞、纖維細胞和膠質(zhì)細胞。對BC和癌旁組織進行免疫組化(IHC)染色，發(fā)現(xiàn)BC組織中CD39表達明顯高于正常膀胱組織(P < 0.001)，此外，CD39表達較高的BC患者預后較差(圖1C-E)。

作者發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤的CD4 +T細胞和CD8 +T細胞均表達了較多的CD39，同時T細胞衰竭的標志—LAG3表達量也有所增加（圖1F,G)，說明CD39表達水平與T細胞衰竭特征呈正相關，同時CD39的表達水平與耗竭CD8 + T細胞的比例呈正相關，這意味著CD39與T細胞的功能障礙也存在著一定相關性。

Result2 CD39i在體內(nèi)抑制BC發(fā)展

作者用POM-1治療小鼠皮下腫瘤模型和小鼠膀胱原位腫瘤模型，結果表明，CD39i能顯著抑制腫瘤生長，提高小鼠存活率（圖2A-C）。在小鼠原位膀胱癌模型中，作者發(fā)現(xiàn)通過CD39i治療可以顯著降低腫瘤的最大橫截面積和小鼠的膀胱重量，再次證明CD39i治療可以顯著抑制腫瘤生長（圖2D-G）。流式分析結果如圖2H–L所示，CD39i治療顯著增加了腫瘤組織中免疫細胞浸潤，包括CD45+細胞、CD4+和CD8+T細胞。為了了解CD39i治療后腫瘤浸潤免疫細胞的全景變化，我們從POM-1和PBS處理組中分選CD45+細胞，然后進行單細胞轉錄組測序。細胞分為了9種主要細胞類型，包括：T細胞、髓細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞（DC）、NK細胞、B細胞、肥大細胞、Ctsk+細胞和惡性細胞。結果表明CD39i和對照組之間CD45+細胞的主要成分沒有顯著變化，僅觀察到CD39i組中T細胞比例有輕微增加（圖2M,N),表明CD39i可能會增加所有免疫細胞類型的豐度。

Result3 CD39i激活了cDC1的增殖

作者進一步對DC進行亞群細分，分成了6個亞群，包括：遷移性DC2 (mDC2)、遷移性DC1?CD80 + (mDC1?CD80 +)、cDC1、cDC1-增殖型(cDC1-p)、常規(guī)2型樹突狀細胞(cDC2)和漿細胞樣DC (pDC)(圖3A-C)。與對照組相比，CD39i治療腫瘤的DC亞群發(fā)生了顯著變化，表現(xiàn)為mDC1?CD80+和pDC減少，cDC1和cDC1-p比例顯著增加(圖3D)。盡管在CD39i處理后，DC亞群的比例發(fā)生了相對重塑，但作者沒有觀察到細胞亞群功能基因的顯著變化(圖3E-G)。這些結果表明，CD39i只是促進了cDC1的擴增，增加了cDC1的比例，沒有對DCs的功能造成明顯影響。

Result4 CD39i治療激活了CD8 + T細胞，促進T細胞增殖

為了進一步研究CD39i介導的T細胞變化，淋巴細胞進一步降維聚類成10個簇，包括：CD8-G2M、CD8-S、CD8-Slfn5、CD8-TRM、CD8-Ifitm1、NK、Th、CD4-Pdcd1、Th17和Treg(圖4A-C)。作者發(fā)現(xiàn)CD39i引起了免疫細胞絕對數(shù)量的增加，其中循環(huán)CD8 + T細胞(CD8- g2m和CD8- s)的增加最為顯著（圖4D）。作者還觀察到Treg豐度略有下降，NK細胞比例略有增加。隨后，作者通過流式細胞術對NK細胞表型進行了分析，發(fā)現(xiàn)CD39i治療顯著增加了CD27+CD11b+和CD27-CD11b+NK細胞的比例，降低了CD27CD11b-和CD27+CD11b-NK細胞比例，表明成熟NK細胞占比增大（圖4E,F）。

此外，作者分析了不同CD8 + T細胞亞群的功能變化，結果表明，經(jīng)CD39i處理后，循環(huán)CD8 + T細胞的常見組織標記物(Gzmk和Cd69)下調(diào)，而與一系列顆粒酶(Gzmb, Gzmc, Gzme, Gzmf)形成有關的eome和Prf1顯著上調(diào)(圖4G)。結合流式細胞術分析，作者發(fā)現(xiàn)CD39i治療促進了T細胞增殖，并通過分泌更多的顆粒酶B和穿孔素增強了T細胞的腫瘤殺傷能力。綜上所述，這些結果表明CD39i激活了細胞毒性T細胞并促進了這些細胞的增殖。

為了探究CD39i是否影響NK細胞、cDC1和T細胞之間的通信網(wǎng)絡，作者構建了細胞-細胞通信網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)cDC1和mDC1表達的Il15、Il12b、Cd80和Cd86，可能會與Il15ra、Il12rb1/2、Cd28相互作用，增強CD8 + T細胞的抗腫瘤活性(圖4H)。之前的研究表明，分泌Il12b的mDC主要來源于cDC1，NK細胞可通過表達Xcl1與cDC1交流，募集cDC1趨向腫瘤細胞，而CD39i可通過增加腫瘤中的NK細胞來增強這一作用?？傮w而言，CD39i加強了NK細胞的浸潤從而募集了更多的cDC1靶向腫瘤, cDC1通過表達Il15、Il12b、Cd80和Cd86來激活周期CD8 + T細胞，從而達到抗腫瘤作用(圖4I)。

Result5 NK細胞的衰竭逆轉了CD39i在體內(nèi)的抗腫瘤作用

為了驗證CD39i對BC的潛在抑制機制，作者再次構建了小鼠皮下腫瘤模型，并將小鼠隨機分為四組，分別用同型對照抗體CD39i、aNK1.1和CD39i+aNK1.1.1處理（圖5A-C)。。與對照組相比，CD39i顯著抑制了腫瘤生長并提高了小鼠的總體存活率（P<0.0001），但在NK細胞缺失的小鼠中，CD39i的作用被顯著逆轉（P<0.001）。此外，我們發(fā)現(xiàn)CD39i增加了對照小鼠中腫瘤浸潤的cDC1的比例（圖5D）以及腫瘤Xcl1蛋白水平，但在NK細胞缺失的小鼠中沒有表現(xiàn)出這一現(xiàn)象。上述結果表明，NK細胞是CD39i發(fā)揮抗腫瘤作用的關鍵。

為了分析Batf3?/?cdc1缺失對腫瘤微環(huán)境和CD39i療效的影響，作者對經(jīng)POM-1或PBS處理的WT和Batf3?/?小鼠進行了單細胞測序，所有細胞被聚集成10個cluster，包括：髓系細胞、T細胞、B細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞(DCs)、NK細胞、肥大細胞、Ctsk+細胞、基質(zhì)細胞和上皮細胞(圖6A,B)。作者發(fā)現(xiàn)CD39i引起了cDC1顯著富集和擴增，而這種效應在Batf3?/?模型中被完全阻斷(圖6C,D)。值得注意的是，在Batf3?/?小鼠中mDC/cDC2比值增加，推測Batf3?/?可能會促進cDC2的成熟。

作者利用Marker基因，進一步將以上樣本的淋巴細胞細分為CD4-C01-Tcm、CD4C02-Th、CD4-C03-Th-PD1、CD4-C04-Th17、CD4-C05-Treg、CD8-C01TRM、CD8-C02-Ifit、CD8-C03-Tex、CD8-C04-Tex、cd8 - c05 - cycle、NK-C01、NK-C02 - c02、NK-C03-Gzmf、NK-C04、nk - c05 - cycle 15個簇(圖6F)。發(fā)現(xiàn)CD39i處理顯著增加了增殖CD8 + T細胞和5種亞型NK細胞的比例，也提高了Batf3?/?cDC1缺陷小鼠中NK細胞數(shù)量(圖6G)。

Result6 以CD39i為基礎的聯(lián)合治療研究

體內(nèi)實驗表明，雖然單獨應用CD39i或aPD-L1抗體治療小鼠，對其皮下腫瘤模型的生長和小鼠的存活率具有相似的治療效果，但聯(lián)合CD39i和aPD-L1共同治療并無產(chǎn)生協(xié)同作用(圖7A-C)。通過流式細胞術分析，我們發(fā)現(xiàn)CD39i處理顯著減少了前體耗竭T細胞的數(shù)量，而aPD-1被認為增強了前體耗竭T細胞的擴增，這可能削弱了它們協(xié)同作用。

接下來，作者嘗試了CD39i、aPD1和CIS不同的組合策略。如圖7D-F所示，在聯(lián)合策略中，CD39i + CIS和aPD1 + CIS在抑制腫瘤生長和改善預后方面具有顯著的協(xié)同作用。為進一步探討CD39i與CIS聯(lián)合的協(xié)同作用機制，作者應用流式細胞術分析不同計劑量的順鉑與CD39i的協(xié)同效果。作者發(fā)現(xiàn)劑量≥3 mg/kg 的順鉑在增加腫瘤中cDC1的比例方面存在協(xié)同作用，但3 mg/kg和4 mg/kg順鉑的效果相同。進一步，我們發(fā)現(xiàn)3 mg/kg的順鉑與CD39i在增加腫瘤浸潤cDC1的比例方面具有協(xié)同作用(圖7G)。

考慮到順鉑會引起腫瘤細胞死亡釋放大量的ATP，而使用CD39i可以抑制細胞外的退化ATP，作者推測兩者結合的方案可能會進一步增加ATP在腫瘤微環(huán)境的積累，產(chǎn)生更強的抗腫瘤效應。CD39i或CD39i與aPD-1聯(lián)合可作為化療后的后續(xù)治療。

研究結論

單細胞測序技術顯著提高了我們對膀胱癌（BC）基因圖譜和分子特征的理解。作者通過單細胞轉錄組分析確定了CD39是BC的潛在治療靶點。在皮下腫瘤模型和原位膀胱癌模型中，聚氧化錫酸鈉（CD39i）對CD39的抑制能夠限制BC的生長并提高患病小鼠的總體存活率。通過單細胞RNA測序，作者發(fā)現(xiàn)CD39i介導腫瘤微環(huán)境發(fā)生了變化，CD39i增加了腫瘤內(nèi)NK細胞、cDC1和CD8+T細胞的比例，并降低了Treg豐度。而NK細胞耗竭模型和cDC1缺陷模型均阻斷了CD39i對腫瘤微環(huán)境的重編程，這意味著NK細胞是CD39i發(fā)揮抗腫瘤作用的關鍵。隨后作者開展了以CD39i為基礎的聯(lián)合治療，發(fā)現(xiàn)CD39i+順鉑的聯(lián)合治療能產(chǎn)生協(xié)同效應，但CD39i+抗PD-L1沒有顯示出協(xié)同效應。本研究揭示了CD39是BD腫瘤微環(huán)境的作用靶點，基于CD39i的聯(lián)合治療方案為膀胱癌的治療提供了新思路。

詳細技術請訪問歐易生物官網(wǎng)

?

百度搜索歐易生物（oebiotech）

?

了解更多多組學技術

（單細胞轉錄組測序?qū)嶒灪头治龅?/strong>）