注：本文不構成任何投資意見和建議，以官方/公司公告為準；本文僅作醫(yī)療健康相關藥物介紹，非治療方案推薦（若涉及），不代表耀海生物立場。任何文章轉載需得到授權。文章導讀：本文詳細概括了CRISPR/Cas系統(tǒng)常見的三種應用模式，包括質粒DNA介導的基因編輯、mRNA介導的基因編輯和Cas蛋白（RNP）介導的基因編輯。然后匯總了CRISPR /Cas基因編輯三大領頭公司（Editas、Intellia和CRISPR）的管線布局和最新臨床進展，并對CRISPR/Cas基因編輯療法的發(fā)展前景進行了展望。主要縮略語：CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats)：成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復序列Cas蛋白(CRISPR-associated [Cas] proteins)：CRISPR相關蛋白RNP?(ribonucleoprotein)：核糖核蛋白，通常由特定RNA和蛋白質組成pDNA?(plasmid DNA)：質粒DNAmRNA?(messenger RNA)：信使RNAsgRNA(single guide RNA)：單向導RNA

一、CRISPR/Cas系統(tǒng)的應用模式

自2013年以來，以CRISPR/Cas9為代表的新一代基因編輯技術嶄露頭角，改變了傳統(tǒng)的基因操作手段。2020年，諾貝爾化學獎授予艾曼紐爾·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpenticr）和詹妮弗·杜德納（Jcnnifer A. Doudna），以表彰她們發(fā)現(xiàn)基因編輯利器之一CRISPR-Cas9。CRISPR-Cas9的發(fā)現(xiàn)簡化了原本繁瑣復雜的基因編輯工作，推動了基因編輯技術的發(fā)展，并在生命科學領域造成革命性的影響。既往菌菌介紹了CRISPR-Cas9的發(fā)展歷程和作用機制，感興趣的可戳鏈接查看全文：基因剪切工具“變形記”——后浪CRISPR-Cas9成長歷程回顧CRISPR/Cas系統(tǒng)有三種常見的應用模式，分別由pDNA (質粒DNA)、mRNA (信使RNA)和RNP復合體 (核糖核蛋白復合體，通常由特定RNA和蛋白質組成)介導。如下圖所示，pDNA、mRNA和RNP復合體遞送至細胞后，歷經不同的胞內過程，在sgRNA (單向導RNA)的導向下，完成靶基因的編輯。由于質粒DNA、mRNA和RNP復合體本質的不同，三者具備不同的胞內過程，三者的生產難度、穩(wěn)定性、起效時間、編輯效率、脫靶效應和安全性也不盡相同。

圖1: CRISPR/Cas系統(tǒng)的三種應用模式

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2. 1.1?pDNA介導的CRISPR/Cas基因編輯

研究人員發(fā)現(xiàn)，可以使用單個或多個質粒編碼Cas9蛋白和sgRNA。質粒DNA遞送至細胞后，轉錄形成Cas9 mRNA和sgRNA，隨后Cas9 mRNA翻譯成Cas9蛋白，與sgRNA形成RNP復合體，完成靶基因的編輯。質粒DNA介導的CRISPR/Cas基因編輯的優(yōu)勢在于質粒DNA易于構建，且生產成本低。然而，質粒DNA介導的CRISPR/Cas基因編輯存在以下風險：第一，必須選擇適合Cas9和sgRNA表達的啟動子以保證基因的表達；其次，Cas9蛋白需經轉錄和翻譯途徑產生，基因編輯時效會延遲；另一方面，質粒DNA介導的Cas9蛋白表達延長，可能增加脫靶效應和免疫原性，且存在質粒DNA與宿主基因組隨機整合的風險。如選擇質粒DNA進行基因編輯，應對其風險進行全面評估。依托大腸桿菌表達系統(tǒng)，耀海生物具備豐富的GMP級別質粒生產服務經驗。在某項質粒服務中，經耀海平臺工藝優(yōu)化，超螺旋質粒的比例提升至95%以上，同時滿足內毒素、宿主DNA殘留等多項指標。如對質粒工藝開發(fā)、GMP級別質粒生產有需求或感興趣，可在文末獲取菌菌聯(lián)系方式。質粒業(yè)務詳情：業(yè)務介紹 | 耀海生物質粒CDMO一站式服務

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2. 1.2?mRNA介導的CRISPR/Cas基因編輯

有研究人員嘗試將Cas9 mRNA和sgRNA共同遞送至靶細胞，利用mRNA介導CRISPR/Cas基因編輯。與質粒DNA相比，mRNA在細胞中的轉換速度更快，限制了蛋白質的持久性，從而減少了潛在的脫靶效應。mRNA體外轉錄、加帽加尾、核苷酸修飾和遞送系統(tǒng)的發(fā)展，逐步解決了mRNA穩(wěn)定性、翻譯效率、免疫原性等挑戰(zhàn)。研究人員通常合成攜帶5’ Cap和poly(A)尾的Cas9 mRNA，增強mRNA在細胞質內的穩(wěn)定性，確保有效的mRNA翻譯。其次，外源性mRNA可被Toll樣受體（TLRs, Toll-like receptors）識別，引發(fā)中重度免疫反應，為避免以上免疫原性，可在mRNA合成過程中耗盡尿苷或摻入假尿苷。也有研究表明，對sgRNA進行化學修飾可提高其穩(wěn)定性、降低免疫原性。Cas9 mRNA與sgRNA均需借助合適的遞送系統(tǒng)保護RNA免受降解，并輔助RNA進入靶細胞。為快速推進mRNA介導的基因編輯研發(fā)進程，耀海生物推出科研級別Cas9 mRNA預制品，純度、完整性和加帽率等指標均達到業(yè)內一級水平，高質量滿足客戶下游實驗需求。mRNA業(yè)務詳情：耀海生物mRNA科研級樣品定制合成一站式解決方案

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2. 1.3?RNP介導的CRISPR/Cas基因編輯

以CRISPR/Cas9為例，RNP復合體由Cas9蛋白和sgRNA組成，通過將Cas9-gRNA RNP遞送到細胞核內發(fā)揮基因編輯作用。RNP介導的CRISPR/Cas9基因編輯有以下優(yōu)勢：第一，Cas9-gRNA復合體可遞送到多種類型的細胞，包括難以轉染的細胞，如免疫細胞和干細胞，這一優(yōu)勢很大程度上決定了Cas9-gRNA RNP的臨床治療潛質。第二，將RNP直接遞送至細胞，可以解決某些罕見真核啟動子導致的蛋白質表達困難，如許多CRISPR質粒中發(fā)現(xiàn)的CMV或EF1A啟動子，保證較高的基因編輯效率。第三，RNP的半衰期較短，限制脫靶效應的可能性。最后，Cas9 RNPs轉染后很快就能檢測到高水平的Cas9 RNPs，隨后通過蛋白質降解途徑迅速從細胞中清除。RNP介導的CRIPR/Cas基因編輯同時面臨一定的挑戰(zhàn)。首先，Cas9蛋白注入血液后易被蛋白酶降解；其次，RNP分子較大，可能限制其穿透細胞膜?？赏ㄟ^選擇合適的遞送載體解決以上難題。另一方面，生產過程中需保證Cas9蛋白純度和活性，這是Cas9蛋白發(fā)揮基因剪刀作用的必要條件。基于多年的微生物表達重組蛋白CDMO服務經驗，耀海生物具備完善的小試工藝開發(fā)及優(yōu)化、中試放大和GMP生產流程。耀海生物交付的重組蛋白純度和活性高、工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，可滿足IND注冊申報需求。重組蛋白業(yè)務詳情：業(yè)務介紹 | 耀海生物重組蛋白CRDMO一站式服務
小結：上文介紹了CRISPR/Cas系統(tǒng)常見的三種應用模式，包括質粒DNA介導的基因編輯、mRNA介導的基因編輯和Cas-RNP介導的基因編輯。由于質粒DNA、mRNA和RNP復合體分子本質的不同，經過不同的胞內過程發(fā)揮作用，因此三者的設計和生產難度、穩(wěn)定性、起效時間、編輯效率、脫靶效應和安全性也不盡相同，詳見下表。表1 DNA、mRNA和Cas-RNP基因編輯的比較

二、Editas、Intellia和CRISPR公司的管線及最新進展

Editas、Intellia和CRISPR三家公司均布局了體內（in vivo）和體外（ex vivo）基因編輯。體內基因編輯是將核酸酶或核酸酶編碼基因，聯(lián)合gRNA直接轉至人體，在體內實現(xiàn)靶基因的編輯，而體外基因編輯在體外使用DNA、mRNA或Cas蛋白對靶細胞進行編輯，隨后輸送至患者體內。表2匯總了三家公司已進入臨床階段的管線，以供參考。表2 Editas、Intellia和CRISPR公司的研發(fā)管線-臨床階段公司項目編號應用模式適應癥研究階段Editas體內EDIT-101DNA-AAVLCA10萊伯爾先天性黑蒙10型Phase I/II體外EDIT-301RNPSCD, TDT鐮狀細胞病, 輸血依賴性β地中海貧血癥Phase I/IIIntellia體內NTLA-2001mRNA-LNPATTR轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性Phase INTLA-2002mRNA-LNP遺傳性血管性水腫Phase I/II體外OTQ923/HIX763UndisclosedSCD鐮狀細胞病Phase I/IINTLA-5001mRNA-LNPAML急性髓性白血病Phase I/IICRISPR體外CTX001/Exa-celRNPSCD, TDT鐮狀細胞病, 輸血依賴性β地中海貧血上市申請CTX110UndisclosedB細胞惡性腫瘤Phase I/IICTX120Undisclosed多發(fā)性骨髓瘤Phase ICTX130Undisclosed腎細胞癌, T或B淋巴細胞Phase IVCTX210UndisclosedT1DI型糖尿病Phase I2.1 Editas Medicine的管線布局與最新研究進展Editas Medicine（以下簡稱Editas）由張鋒參與創(chuàng)辦，聚焦于兩種CRISPR核酸酶Cas9和Cas12a。據網站公開信息，Editas布局了4個體內基因編輯管線，以DNA介導的模式為主，其中進展最快的是EDIT-101，適應癥是萊伯爾先天性黑蒙10型（LCA10, Leber Congenital Amaurosis 10），當前處于I/II期臨床階段，已公布積極結果；EDIT-102和EDIT-103仍處于臨床前階段，適應癥分別為遺傳性耳聾-色素性視網膜炎綜合征（USH2A, Usher Syndrome 2A）、視紫紅質相關常染色體顯性視網膜色素變性（RHO-adRP, Rhodopsin-Associated Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa）。另一項用于眼科疾病的管線仍處于早期發(fā)現(xiàn)階段。EDIT-101、EDIT-102和EDIT-103均以腺相關病毒（AAV, adeno-associated virus）為載體，將Cas9蛋白編碼基因和向導RNA編碼基因遞送至體內。Editas在體外基因編輯領域開發(fā)了EDIT-301，正在開展I/II期臨床研究，適應癥是鐮狀細胞病（SCD, Sickle Cell Disease）和輸血依賴性β地中海貧血癥（TDT, Transfusion-Dependent Beta-Thalassemia）。EDIT-301療法將Cas12a與gRNA組成的RNP復合體轉至細胞內，隨后輸送到患者體內，已取得積極的初期臨床數據。
2.2 Intellia Therapeutics的管線與最新研究進展Intellia Therapeutics（以下簡稱Intellia）由諾獎得主Jennifer Doudna創(chuàng)辦，目前公布了8個體內基因編輯管線和6個體外基因編輯管線，其中4個管線已進入臨床階段。體內基因編輯領域進展較快的有NTLA-2001和NTLA-2002，屬于mRNA介導的基因編輯，使用脂質納米顆粒（LNP）包封Cas9 mRNA和sgRNA。NTLA-2001目前處于I期臨床階段，由Intellia和再生元共同開展，適應癥是轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（ATTR, Transthyretin Amyloidosis）。Intellia和再生元于2021年公布了NTLA-2001的早期臨床結果，并發(fā)表在頂級醫(yī)學期刊NEJM（新英格蘭雜志）。2022年11月，Intellia公布了NTLA-2002的最新臨床進展，其治療遺傳性血管水腫（HAE）I/II期臨床試驗的中期數據顯示了積極的結果。此外，有多項體內編輯療法仍處于臨床前階段，擬開發(fā)適應癥涉及血友病、α-1抗胰蛋白酶缺乏癥。體外基因編輯方面，Intellia和諾華合作研究的OTQ923/HIX763處于I期臨床，適應癥為鐮狀細胞病。腫瘤領域的多個基因編輯管線也處于開發(fā)階段。
2.3 CRISPR Therapeutics的管線布局與最新研究進展CRISPR Therapeutics（以下簡稱CRISPR）的創(chuàng)始團隊包括諾獎得主Emmanuelle Charpentier，CRISPR公司在體外基因編輯領域進展較快，體內基因編輯管線仍處于臨床前階段。在體外基因編輯方面，CRISPR公司的CTX001（Exa-cel, exagamglogene autotemcel）已發(fā)展至上市申請階段，適應癥是鐮狀細胞?。⊿CD）和輸血依賴性β地中海貧血癥（TDT）。據CRISPR公司早期公告，CTX001將于2022年11月向FDA滾動提交上市申請，預計在2023年第一季度末完成提交，有望成為首款上市的CRISPR基因編輯療法。其他體外基因編輯管線CTX110、CTX120、CTX130和VCTX210處于I-II期臨床階段，適應癥包括B細胞惡性腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤、腎細胞癌或T/B淋巴細胞癌、I型糖尿病。

展望

文章介紹了CRISPR/Cas系統(tǒng)常見的三種應用模式，包括質粒DNA介導的基因編輯、mRNA介導的基因編輯和Cas-RNP介導的基因編輯。然后匯總了CRISPR /Cas基因編輯三大領頭公司（Editas、Intellia和CRISPR）的管線布局和最新臨床進展。從管線布局來看，三家公司核心技術不盡相同，Editas公司在體內基因編輯領域專注于以AAV為載體的DNA，在體外基因編輯領域專注于RNP技術，適應癥以罕見遺傳病為主。CRISPR公司體外基因編輯同樣聚焦于RNP，適應癥包括罕見遺傳病、腫瘤、代謝性疾病。而Intellia公司則以mRNA為核心技術，布局了體內和體外基因編輯技術。綜上所述，CRISPR/Cas系統(tǒng)常見的三種應用模式包括質粒DNA、mRNA和Cas-RNP介導，三種技術各有優(yōu)劣，不同公司圍繞不同的核心技術開展驗證性試驗。當前基因編輯療法的長期安全性仍需在長期試驗中進行驗證，但“一次治療，終身受益”的特質將會不斷吸引企業(yè)躋身基因編輯的創(chuàng)新藥賽道。

參考文獻：

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