質(zhì)粒擴增-包病毒-病毒感染
質(zhì)粒擴增
試劑準備：
LB培養(yǎng)基：
????胰蛋白胨 ? ?10g/L
????酵母提取物 5g/L
????NaCl??10g/L
倒平板需要的瓊脂培養(yǎng)基
? ? 胰蛋白胨? ? 16g/L
????酵母提取物 10g/L
????NaCl? 5g/L
????瓊脂粉 15g/L
配置好后高壓蒸汽滅菌，瓊脂培養(yǎng)基不燙手時加入氨芐（買來后，將粉末用超純水配置成100mg/ml，用的時候1：1000加），倒平板，封口膜封好，4°放置備用
第一天：
從-80冰箱取出30ul感受態(tài)大腸桿菌（30ul即可，方便后面挑單克?。┲糜诒先诨?/p>
快速加入1ug（大約2ul）質(zhì)粒溶液，輕輕搖勻
冰浴30min
置于42℃水浴/金屬浴中熱激90s（精準把控時間），熱激過程不要移動離心管
冰上2min
加入700ul無抗性LB，37℃搖床40-60min
無需離心，輕輕混勻取20ul，加入80ul的LB培養(yǎng)基（剩下的可以放于4°，方便繼續(xù)涂板）
100ul用于涂板，玻璃珠或者玻璃棒都可以
過夜培養(yǎng)，14-16h，<18h
第二天：
經(jīng)過第一天的操作將獲得單克隆培養(yǎng)皿
準備一個50ml離心管，加入20ml抗性（含有氨芐1：1000）LB培養(yǎng)基
挑菌落（大小適中，3-5個，最好不要挑單菌落，防止有突變），拿槍頭戳一下或者劃一下菌落，打入50ml管中
稍微擰松瓶蓋，并用膠布固定，用完的培養(yǎng)皿可以用封口膜纏好，方便繼續(xù)搖菌
過夜搖菌（37°搖床），可以根據(jù)渾濁情況，離心菌量，適當延長搖菌時間
第三天：
收集菌液，4500rpm離心為提取質(zhì)粒準備
根據(jù)具體試劑盒說明說操作
我這用的是天根生化(TIANGEN)的無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒
需要注意的地方我框了出來
包裝病毒
原理：
所用細胞類型：293T
試劑準備：HilyMax
操作步驟：
?。。∷谢靹蚨际禽p輕的混！
1.293T細胞密度80%左右最為適宜（細胞狀態(tài)好成功率高），提前將293培養(yǎng)基37℃預(yù)熱，提前1-4h換液（10cm皿+9ml培養(yǎng)基）；
2.準備一個EP管，加入900ulDMEM；
3.向EP管中加入5ug的PLP1,PLP2,PLP-VSVG，以及目的質(zhì)粒，輕輕混勻；
4.向EP管中加入40ulHilyMax，輕輕混勻，靜置15min；
5.EP管內(nèi)試劑全部轉(zhuǎn)移至293T細胞培養(yǎng)皿中，此時不要混勻吹打，緩慢搖勻，不要劇烈晃動。
6.6-10h換液（先預(yù)熱培養(yǎng)基）
7.48h后收病毒，換液（預(yù)熱），+24h后二次收病毒
8.病毒液吸入15ml離心管，為方便二次收病毒需立即加入新培養(yǎng)基，吸出的病毒液，1500rpm/10min
9.10ml注射器吸取上清，取下針頭，插上0.45um過濾器，然后分裝到1.5mlEP管中，每管1ml（儲存于-80冰箱）。每次取兩個加入到小皿中，再加1ml培養(yǎng)基來感染。
或者
打入濃縮管中，4000G/10min，吸取濃縮病毒液轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管（400ul），測蛋白濃度，-80儲存。
病毒感染
小皿+1ml培養(yǎng)基，2ml病毒液，3ul polybrene，8-12h換液
傳到10cm大皿中，待長滿后，傳代，傳兩個大皿，同時加入嘌呤霉素或其他抗性的藥物篩選
????????????第一次篩，10ml先加7ul，后面再增加到10ul，篩兩次，約一周
