煙曲霉是曲霉屬中的一種真菌，并且是引起免疫缺陷患者疾病的最常見曲霉之一。可以在整個環(huán)境中找到它，包括土壤，植物物質和家庭灰塵中。人和動物不斷吸入這種真菌的分生孢子。通常，先天性免疫機制會在具有免疫能力的宿主中消除分生孢子，而曲霉菌和過敏性支氣管肺曲菌病則是罕見的臨床癥狀。因此，多年來，煙曲霉被認為是一種弱病原體。如今，煙曲霉因其生存的環(huán)境和人類生活中起著重要作用而現(xiàn)在在研究中變得越來越流行。此外，CRISPR/Cas9是一種新型的基因組編輯系統(tǒng)，已在煙曲霉中成功建立。科學家已經為煙曲霉產生了一個CRISPR系統(tǒng)，以通過基因敲除，基因敲入，點突變等研究其功能。

煙曲霉是曲霉病的最常見原因之一。第一個是過敏性支氣管肺曲霉病，它是對曲霉孢子的過敏反應。這種反應會導致呼吸道和肺部受損。通常在患有哮喘和囊性纖維化等疾病的人中發(fā)現(xiàn)。第二種是慢性肺曲霉病，它可能發(fā)生在患有慢性肺部疾病的人中，導致在肺中形成稱為空洞的空氣空間。第三個是侵襲性曲霉病，它是最嚴重的曲霉病形式，如果不治療可能致命。當曲霉菌感染開始于肺部并擴散到人體的其他部位，例如皮膚，大腦或腎臟時，就會發(fā)生這種情況。侵襲性曲霉病僅在免疫系統(tǒng)嚴重弱化的人中發(fā)生。

煙曲霉靶向基因破壞的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的開發(fā)

為了測試CRISPR/Cas9系統(tǒng)在煙曲霉中靶向基因破壞的可行性。作為原理的證明，研究人員首先證明了CRISPR/Cas9確實可以用于煙曲霉聚酮化合物合酶基因（pksP）的高效靶向（25％至53％），這一點已通過無色（白蛋白）的產生得以證明。具有預期的基因組改變的突變體。研究人員進一步證明，Cas9核酸酶本身的組成型表達對煙曲霉的生長或毒力無害，因此使CRISPR系統(tǒng)與發(fā)病機理研究兼容。綜上所述，這些數據表明，CRISPR可用于煙曲霉的功能喪失研究，并有可能增強這一重要病原體的遺傳工具箱。

使用CRISPR進行煙曲霉的基因操作

該技術的當前狀態(tài)嚴重依賴于基于DNA的表達盒，將Cas9和引導RNA（gRNA）傳遞至細胞。因此，技術的力量僅限于為表達Cas9和gRNA而設計的菌株。為了克服這些限制，研究人員開發(fā)了一種簡單且通用的CRISPR-Cas9系統(tǒng)用于基因編輯的刪除，該系統(tǒng)可在煙曲霉的不同遺傳背景下工作。該系統(tǒng)采用雙重Cas9核糖核蛋白（RNP）的體外組裝來靶向基因刪除。此外，CRISPR-Cas9系統(tǒng)利用35至50 bp的側翼區(qū)域介導Cas9雙鏈斷裂（DSB）處的同源重組。在臨床分離株DI15-102中獲得了相似的刪除效率。數據表明，體外組裝的Cas9 RNP與微同源修復模板是一種用于煙曲霉基因操縱的有效且通用的系統(tǒng)。在這項研究中，要解決煙曲霉的毒力和抗真菌藥物耐藥性的多因素性質，需要對多種基因進行機械詢問，有時跨多個遺傳背景。經典的真菌基因替換系統(tǒng)可能很費力且費時，并且在野生型分離株中，同源重組率低。在這項研究中，用于基因操作的簡單通用CRISPR-Cas9系統(tǒng)在煙曲霉的不同遺傳背景下產生了有效的基因靶向。

Ubigene開發(fā)了CRISPR-B?，可優(yōu)化微生物基因編輯載體和工藝。效率和準確性比傳統(tǒng)方法高得多。?CRISPR-B?可用于細菌和真菌的基因編輯。輕松實現(xiàn)微生物基因敲除（KO），點突變（PM）和敲入（KI）。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產。一些研究人員利用基因細胞敲除切割效率系統(tǒng)產生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產生了EPO的穩(wěn)轉細胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細胞生成素在人體內穩(wěn)定表達的機制。

根據科研需求，結合靶基因的情況進行基因穩(wěn)轉敲除方案設計。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設在外顯子2兩端的內含子中，敲除外顯子編碼堿基數為非3倍數，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設在外顯子上，缺失的堿基數為非3倍數，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。

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