哥倫比亞大學(xué)TalDanino、Kam W. Leong等人在Nature Biotechnology上發(fā)表了題為“A programmable encapsulation system improves delivery of therapeutic bacteria in mice”的論文，提出了一種可調(diào)節(jié)的微生物表面工程策略，使用合成基因回路來動態(tài)控制細(xì)菌與其周圍環(huán)境的相互作用。

本研究內(nèi)容基于腫瘤細(xì)菌療法，小編先來解釋腫瘤細(xì)菌療法的機(jī)制。腫瘤細(xì)菌療法：進(jìn)入腫瘤組織的細(xì)菌，無論是活菌還是滅活細(xì)菌，都可誘發(fā)機(jī)體的固有免疫和適應(yīng)性免疫，進(jìn)而改變腫瘤免疫微環(huán)境。機(jī)體的天然免疫細(xì)胞可識別細(xì)菌上的病原體相關(guān)分子模式，吞噬并摧毀細(xì)菌，分泌細(xì)胞因子，同時觸發(fā)更為特異性的適應(yīng)性免疫。此外，細(xì)菌可利用其大量不同的理化性質(zhì)（如脂肪、蛋白等天然成分），借助樹突狀細(xì)胞的交叉遞呈作用，誘導(dǎo)CD4+和CD8+T細(xì)胞相結(jié)合殺傷腫瘤。這里又提到了新名詞，交叉遞呈作用。根據(jù)抗原的來源及性質(zhì)，DCs主要通過MHCⅠ類分子提呈途徑、MHCⅡ類分子提呈途徑和交叉提呈途徑對抗原進(jìn)行加工和提呈。MHCⅠ類分子提呈途徑是指內(nèi)源性的抗原被降解成抗原肽并裝載于MHCⅠ類分子，提呈給CD8+T細(xì)胞的過程；MHCⅡ類分子提呈途徑是外源性抗原通過吞噬、胞飲、受體介導(dǎo)等內(nèi)吞作用攝取抗原，裝載到MHCⅡ類分子，提呈給CD4+T細(xì)胞的過程；交叉提呈途徑則是DCs對外源性抗原的一種抗原提呈方式，即外源性抗原經(jīng)DCs作用后與MHCⅠ類分子形成復(fù)合體，提呈給CD8+T細(xì)胞的過程。再介紹內(nèi)源和外源性抗原的分類。內(nèi)源性抗原是指在抗原提呈細(xì)胞內(nèi)新合成，存在于胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)抗原。外源性抗原是指抗原提呈細(xì)胞從胞外攝取，存在于細(xì)胞囊膜系統(tǒng)內(nèi)的蛋白質(zhì)抗原。例如，細(xì)菌蛋白等外來抗原通過胞吞、胞飲和受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用進(jìn)入抗原提呈細(xì)胞內(nèi)。微生物可以被設(shè)計為一種可以感知和反應(yīng)環(huán)境的智能生物藥物，它們可以定植在體內(nèi)，實現(xiàn)局部治療。然而，活細(xì)菌的宿主毒性限制了可耐受劑量和療效。與傳統(tǒng)藥物載體不同的是，細(xì)菌功能的獨(dú)特性在于持續(xù)增殖、轉(zhuǎn)移、在腫瘤組織中遞送藥物，因此，在藥物代謝動力學(xué)層面上必須對其進(jìn)行穩(wěn)定和時間控制。一種規(guī)避活細(xì)菌治療的免疫原性和毒性的方法是將抗原的基因敲除，如脂多糖（LPS）。但是這種方法會導(dǎo)致永久的細(xì)菌衰減，減少定殖量。表面修飾已廣泛應(yīng)用于給藥載體，因此，之前的研究提出了為微生物制造合成的表面涂層，如海藻酸鹽、殼聚糖、聚多巴胺、脂類、納米顆粒等。這些一次性的細(xì)菌靜態(tài)修飾不允許原位調(diào)節(jié)，并可能導(dǎo)致不受控制的生長、脫靶毒性或細(xì)胞功能受損，從而導(dǎo)致療效降低。因此，在不影響安全性的情況下提高細(xì)菌治療效果是癌癥活體微生物治療臨床轉(zhuǎn)化的核心挑戰(zhàn)。本文利用基因合成線路設(shè)計了一種可調(diào)節(jié)的微生物表面改造策略，動態(tài)控制細(xì)菌與周圍環(huán)境的相互作用。莢膜多糖（CAP）是一種天然的包裹在細(xì)胞外膜上的生物聚合物，能夠保護(hù)微生物免受環(huán)境的干擾。在人體中，CAP可以保護(hù)細(xì)菌免受各種免疫因子的干擾，促進(jìn)其存活和定殖。受此啟發(fā)，研究人員構(gòu)建了一個CAP表達(dá)系統(tǒng)，通過外部誘導(dǎo)劑調(diào)節(jié)細(xì)菌表面，從而控制細(xì)菌與抗菌素、噬菌體、酸度、宿主免疫之間的相互作用。本文基于對莢膜生物合成途徑的小分子RNA篩選，構(gòu)建了一種調(diào)節(jié)細(xì)菌封裝的可誘導(dǎo)合成基因片段。這些細(xì)菌能夠暫時逃避免疫攻擊，而隨后的封裝損失可使其在體內(nèi)被有效清除。動態(tài)給藥策略使細(xì)菌的最大耐受劑量增加了10倍。原位封裝增加了小鼠腫瘤中微生物易位的比例，使其對遠(yuǎn)端腫瘤同樣有效。

可用于治療的細(xì)菌較多，經(jīng)免疫原性和活性比較，E.coli Nissle 1917（EcN），具有良好的臨床表現(xiàn)，在人體全身血管中活性較高，注射后在小鼠體內(nèi)引起的免疫反應(yīng)最小。EcN的k5-CAP可以改變與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用，因此被選來從基因上修飾其生物合成途徑。k5-CAP，也被稱為肝聚糖，是由交替的β-D-葡萄糖醛酸（GlcA）和N乙酰αD葡萄糖胺（GlcNA）組成的聚合物鏈，再連接到3-脫氧-D-甘露-oct-2-葡萄糖酸（Kdo）連接體

?

圖1??用于控制細(xì)菌封裝和體內(nèi)傳遞的CAP系統(tǒng)

圖2??敲除CAP生物合成中的關(guān)鍵基因

本部分小結(jié)：

1.?????基于上述研究，選擇kfiC，一種編碼GlcNAc糖轉(zhuǎn)移酶的基因，這種糖轉(zhuǎn)移酶的丟失會導(dǎo)致CAP無法產(chǎn)生。

2.?????kifC越少，血液敏感性越強(qiáng)，因此可以通過控制基因表達(dá)來選擇性調(diào)節(jié)免疫保護(hù)的水平。

3.?????驗證細(xì)菌表面CAP是否存在，采用噬菌體斑塊試驗（Phageplaque formation assay）；純化和檢測細(xì)菌雜多糖，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAEG）；觀察形態(tài)學(xué)變化，掃描電鏡（TEM）。

4.?????研究了CAP保護(hù)細(xì)胞免受多種抗菌因子影響的能力，EcNΔkfiC對抗生素的細(xì)胞保護(hù)作用顯著降低。

綜上，CAP的丟失改變了細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)和對抗菌因子的保護(hù)作用。

圖3? iCAP系統(tǒng)的設(shè)計和表征

本部分小結(jié)：

1.??????轉(zhuǎn)化了低拷貝數(shù)質(zhì)粒的EcNΔkfiC對ΦK1-5具有完全的免疫力。

2.??????隨著IPTG水平的升高，EcN-iCAP系統(tǒng)的CAP產(chǎn)量增加EcN-iCAP的活力降低，細(xì)菌膜的平均膜厚度從44增加到81nm，證實了該系統(tǒng)的可調(diào)能力。

3.??????評估了iCAP系統(tǒng)的生產(chǎn)和回收，加入IPTG后，觀察到CAP的產(chǎn)量升高，在6小時后達(dá)到接近最大水平；去除IPTG導(dǎo)致CAP逐漸下降，6小時后完全抑制；通過與ΦK1-5共孵育測試iCAP的動態(tài)：未誘導(dǎo)的EcNiCAP生長，但在共孵育開始時，用IPTG誘導(dǎo)導(dǎo)致3.5小時的快速裂解，SDS-PAGE觀察到的CAP產(chǎn)生延遲。

圖4? CAP系統(tǒng)與宿主免疫因子的可調(diào)性相互作用

本部分小結(jié)：

1.?????經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的EcN-iCAP存活率高于未經(jīng)誘導(dǎo)組，增加IPTG水平可以使細(xì)菌存活率至少提高105倍。

2.?????在不同IPTG濃度下短暫激活EcN-iCAP后觀察細(xì)菌隨時間的存活情況。野生型EcN存活時間超過6小時，EcN-ΔkfiC在前0.5小時內(nèi)迅速下降到檢測下限。

3.?????共培養(yǎng)EcN-iCAP與BMDMs，觀察到提前進(jìn)行iCAP激活組中巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的攝取減少。

4.?????與未誘導(dǎo)的對照相比，IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌的吞噬作用減少10倍。

5.?????CAP的缺失提高了許多炎癥細(xì)胞因子的水平，而加入IPTG誘導(dǎo)后炎癥細(xì)胞因子水平恢復(fù)。

圖5??瞬時CAP激活提高了體內(nèi)細(xì)菌的全身遞送和療效

?

本部分小結(jié)：

1.?????EcN小鼠體內(nèi)的急性炎癥細(xì)胞因子水平低于EcNΔkfiC組。

2.?????EcN-iCAP比EcNΔkfiC誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)少，說明ECN-iCAP在體內(nèi)成功封裝。

3.?????長期追蹤發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞數(shù)量會增加，即持續(xù)存在的CAP可能導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)和毒性。

4.?????瞬時誘導(dǎo)的EcN-iCAP的可耐受劑量比EcN和EcNΔkfiC高10倍。

5.?????腹腔注射細(xì)菌致膿毒癥以模擬嚴(yán)重毒性，發(fā)現(xiàn)EcN-iCAP的安全性明顯高于其他兩組。

6.?????研究注射后體內(nèi)分布情況，在外周器官中發(fā)現(xiàn)的EcN和EcN-iCAP比EcNΔkfiC減少了約10倍。

7.?????驗證抗腫瘤效果，EcN-iCAP在腫瘤中的信號明顯高于其他所有組，單次以可耐受劑量給藥的EcN-iCAP組可顯著抑制腫瘤生長，且小鼠體重?zé)o明顯變化。

8.?????注射2天后分離瘤內(nèi)細(xì)菌，在含有ΦK1-5的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，EcN-iCAP、可以生長，說明腫瘤細(xì)胞中無CAP。

綜上所述，iCAP系統(tǒng)能夠增加可耐受的細(xì)菌劑量并提高治療效果。

圖6??原位激活CAP使Ec易位到遠(yuǎn)端腫瘤進(jìn)行治療

本部分結(jié)論：

如圖6所述，與未誘導(dǎo)的細(xì)菌相比，細(xì)菌向遠(yuǎn)端腫瘤的易位明顯增加。

劑量毒性一直是臨床轉(zhuǎn)化上的一個難點(diǎn)，近來的一些研究多關(guān)注于基因減毒工程菌，但在細(xì)菌傳遞策略上仍有待改進(jìn)。本研究展示了一種合成生物學(xué)方法，可用于在體內(nèi)治療遞送階段動態(tài)和可調(diào)地調(diào)節(jié)細(xì)菌表面。本研究中發(fā)現(xiàn)的其他基因也可用于控制不同的敏感性或獨(dú)立地改變細(xì)菌對各種環(huán)境因素的敏感性。同時，這種方法可以應(yīng)用于其他大腸桿菌菌株