【肺部發(fā)育】細(xì)胞分化竟如此神奇？PNAS研究揭秘下呼吸道秘密
本文來(lái)源：類(lèi)器官學(xué)社
當(dāng)下，肺部疾病的發(fā)病率日益增加，而我們對(duì)于肺部發(fā)育和致病機(jī)制的認(rèn)識(shí)卻非常有限，這給肺部疾病的治療帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。幸運(yùn)的是，類(lèi)器官作為一種優(yōu)質(zhì)的體外模型，為我們深入了解肺部的發(fā)育和病理過(guò)程提供了有力的支持。
今天小學(xué)社給大家?guī)?lái)一篇關(guān)于類(lèi)器官研究肺部發(fā)育中細(xì)胞異質(zhì)性的文獻(xiàn)。讓我們一起來(lái)了解一下吧！
過(guò)去幾十年來(lái)，科學(xué)家們主要利用形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和低通量方法來(lái)研究人體組織中有限數(shù)量的蛋白質(zhì)和mRNA。然而，隨著單細(xì)胞基因組學(xué)和高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法的發(fā)展，人體器官內(nèi)特定細(xì)胞類(lèi)型的鑒定和表征變得更加準(zhǔn)確，從而可以研究組織組成、細(xì)胞異質(zhì)性和組織功能。
近年來(lái)，在肺部領(lǐng)域，大量單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)揭示了成人肺部在平衡狀態(tài)或病理狀態(tài)下的細(xì)胞異質(zhì)性。此外，一些研究還發(fā)現(xiàn)了新的細(xì)胞類(lèi)型和狀態(tài)，揭示了人類(lèi)肺部發(fā)育的復(fù)雜性。然而，由于倫理問(wèn)題和組織獲取困難的限制，目前研究人類(lèi)器官和組織的功能性仍然存在一些難題。
芽尖類(lèi)器官(BTO)線(xiàn)路建立、培養(yǎng)和氣道分化
區(qū)域氣道類(lèi)器官的建立和培養(yǎng)
類(lèi)器官組織scRNA測(cè)序
細(xì)胞標(biāo)記、文庫(kù)制備和慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)成類(lèi)器官
細(xì)胞標(biāo)記氣道類(lèi)器官的分析
1. 由SCGB3A2/SFTPB/CFTR共表達(dá)定義的上皮細(xì)胞
該研究使用單細(xì)胞 RNA 測(cè)序（scRNA-seq）分析了受孕后數(shù)周人肺組織中氣管、近端和遠(yuǎn)端氣道的上皮細(xì)胞的異質(zhì)性，并鑒定了多個(gè)細(xì)胞類(lèi)型。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一種新的細(xì)胞群體下氣道祖細(xì)胞（LAP），并進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。研究發(fā)現(xiàn)，LAP細(xì)胞不表達(dá)俱樂(lè)部細(xì)胞標(biāo)記物和肺泡標(biāo)記物，但表達(dá)與俱樂(lè)部細(xì)胞、肺泡II型細(xì)胞和離子細(xì)胞相關(guān)的基因。通過(guò)熒光原位雜交（FISH）技術(shù)發(fā)現(xiàn)，LAP細(xì)胞在人胎兒肺的多個(gè)發(fā)育階段中廣泛存在，并且可通過(guò)SCGB3A2和?SFTPB的共表達(dá)來(lái)鑒定。
研究還揭示了LAP細(xì)胞在肺的發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空分布和豐度變化，表明LAP細(xì)胞在小軟骨區(qū)(52.4%)和非軟骨性氣道區(qū)(54.2%)最為豐富，在近端(氣管，大軟骨)或遠(yuǎn)端(細(xì)支氣管，芽尖)的細(xì)胞較少（圖1）。
圖1
2.?體外芽尖類(lèi)器官分化模型對(duì)LAP細(xì)胞進(jìn)行功能性研究
該研究使用原代人類(lèi)芽尖類(lèi)器官（BTO）作為模型，通過(guò)“雙SMAD激活/抑制”法在21天內(nèi)誘導(dǎo)分化為氣道細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，BTO可以在21天內(nèi)分化為氣道細(xì)胞，包括基底細(xì)胞、多纖毛細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和分泌細(xì)胞。分子研究表明，在分化過(guò)程中，LAP細(xì)胞的標(biāo)記物(SCGB3A2、SFTPB)表達(dá)逐漸增加，并且在21天的氣道類(lèi)器官中存在著共表達(dá)LAP細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞。這些結(jié)果表明，21天氣道類(lèi)器官分化模式是一個(gè)有效研究LAP細(xì)胞功能的模型。
3. LAP細(xì)胞是肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞（PNEC）和多纖毛細(xì)胞的祖細(xì)胞
該研究使用氣道類(lèi)器官模型研究了LAP細(xì)胞在氣道分化過(guò)程中的作用。研究人員使用CellTagging技術(shù)標(biāo)記和追蹤單個(gè)細(xì)胞的克隆，利用這種技術(shù)將病毒標(biāo)記轉(zhuǎn)導(dǎo)21天誘導(dǎo)的氣道類(lèi)器官中，并通過(guò)細(xì)胞分選的方法分離出標(biāo)記的細(xì)胞。研究通過(guò)基于基因模塊的細(xì)胞評(píng)分方法鑒定了這些標(biāo)記細(xì)胞的類(lèi)型并發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的LAP細(xì)胞與胎兒LAP細(xì)胞簇具有高度相似的轉(zhuǎn)錄特征。
研究人員進(jìn)一步對(duì)CellTag克隆分布進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)LAP克隆在細(xì)胞類(lèi)型和分泌細(xì)胞中存在不同的細(xì)胞譜系。此外，PNEC/PNEC前體和多纖毛細(xì)胞/多纖毛前體與LAP細(xì)胞具有相同的細(xì)胞起源，而分泌細(xì)胞和多纖毛細(xì)胞/多纖毛前體與基底細(xì)胞具有相同的細(xì)胞起源（圖1A、2A-F）。
圖2
4.?LAP 細(xì)胞和基底細(xì)胞導(dǎo)致多纖毛細(xì)胞異質(zhì)性
研究發(fā)現(xiàn)人肺氣道中的多纖毛細(xì)胞表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)和計(jì)算分析發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源和位置的多纖毛細(xì)胞存在區(qū)域差異的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。研究人員提出了一種改進(jìn)的肺氣道分化模型，其中芽尖祖細(xì)胞（BTP）產(chǎn)生LAP和基底細(xì)胞，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為不同類(lèi)型的細(xì)胞。通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)兩個(gè)候選基因（C6和MUC16），在多纖毛細(xì)胞中的表達(dá)水平有差異。研究人員觀察到基底細(xì)胞在近端氣道中更豐富，LAP細(xì)胞在下氣道中更豐富，表明多纖毛細(xì)胞亞群在肺近端和遠(yuǎn)端軸上可能存在異質(zhì)性。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多纖毛細(xì)胞和PNEC標(biāo)記共表達(dá)LAP細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明，多毛細(xì)胞是異質(zhì)的，具有區(qū)域不同的基因譜，這與下氣道LAP細(xì)胞或上氣道和氣管基底細(xì)胞的解剖富集有關(guān)。（圖2、3）
圖3
5.?氣道類(lèi)器官保留區(qū)域模式和細(xì)胞異質(zhì)性
該研究利用氣管和原代胎兒肺組織建立了不同的類(lèi)器官系，以研究氣道內(nèi)的區(qū)域異質(zhì)性。研究發(fā)現(xiàn)，氣管類(lèi)器官富集了基底細(xì)胞標(biāo)記物和MUC16，含有SCGB3A1+和SCGB1A1+細(xì)胞，但沒(méi)有SCGB3A2+細(xì)胞。相比之下，無(wú)軟骨性氣道（NCA）類(lèi)器官中基因表達(dá)量顯著增加，多纖毛標(biāo)記和肺泡標(biāo)記物表達(dá)也較高。NCA類(lèi)器官中有少量的SCGB1A1+和SCGB3A1+細(xì)胞，但不表達(dá)SCGB3A2。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這些類(lèi)器官在NCA區(qū)域的氣道組織中富集（圖3E-G）。
6.?基礎(chǔ)細(xì)胞譜系和 LAP 細(xì)胞譜系的體外功能評(píng)估
該研究使用熒光活化細(xì)胞分選（FACS）從NCA類(lèi)器官中分離了基底細(xì)胞和LAP細(xì)胞，并分別擴(kuò)增成類(lèi)器官并進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，基底細(xì)胞富集于EGFR和F3，而LAP細(xì)胞富集于MUC1。進(jìn)一步的分析顯示，F(xiàn)3/ EGFR-類(lèi)器官中存在豐富的基底細(xì)胞標(biāo)記物和TP63+細(xì)胞以及SCGB1A1、FOXJ1+細(xì)胞，但缺乏LAP和PNEC細(xì)胞。相反，MUC1-類(lèi)器官中富集了LAP細(xì)胞標(biāo)記物、FOXJ1+細(xì)胞和PNEC細(xì)胞，并包含少量基底細(xì)胞和SCGB1A1細(xì)胞。F3/ EGFR-類(lèi)器官中MUC16/FOXJ1細(xì)胞的比例顯著高于C6/FOXJ1細(xì)胞，而MUC1類(lèi)器官中C6/FOXJ1細(xì)胞的比例顯著高于MUC16/FOXJ1細(xì)胞。
此外，SCGB1A1和MUC5B的表達(dá)在這些培養(yǎng)中沒(méi)有顯著差異。F3/ EGFR-類(lèi)器官產(chǎn)生的基底細(xì)胞衍生的類(lèi)器官?zèng)]有LAP細(xì)胞和PNEC，而MUC1-類(lèi)器官產(chǎn)生的LAP細(xì)胞衍生的類(lèi)器官具有PNEC和多纖毛細(xì)胞（圖4）。
圖4
隨著單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人類(lèi)肺部細(xì)胞的多樣性研究取得了重大突破。深入評(píng)估這些新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞類(lèi)型和功能狀態(tài)對(duì)于理解它們?cè)诜尾抗δ苤械淖饔弥陵P(guān)重要。鑒于動(dòng)物模型的局限性，越來(lái)越多的研究需要使用體外人類(lèi)模型進(jìn)行相關(guān)功能研究。
類(lèi)器官是一種自我組織能力強(qiáng)的3D微型細(xì)胞簇，能夠高度模擬人體器官的結(jié)構(gòu)和功能，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究中，研究人員成功構(gòu)建了類(lèi)器官模型，用于研究LAP細(xì)胞在人類(lèi)肺發(fā)育過(guò)程中的作用。預(yù)計(jì)未來(lái)，類(lèi)器官將在更多研究領(lǐng)域發(fā)揮作用，有助于揭示生物學(xué)領(lǐng)域的奧秘！
本文來(lái)源：類(lèi)器官學(xué)社
