神經(jīng)退行性疾病是由進(jìn)行性神經(jīng)細(xì)胞死亡引起的無(wú)法治愈的疾病。色素性視網(wǎng)膜炎（RP）是一種致盲性神經(jīng)退行性疾病，可導(dǎo)致光感受器死亡甚至失去視網(wǎng)膜。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)和質(zhì)譜成像技術(shù)（空間代謝組學(xué)）研究，間接活檢視網(wǎng)膜，識(shí)別視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)組的變化可為保護(hù)視網(wǎng)膜提供理論依據(jù)。

2020年1月，美國(guó)斯坦福大學(xué)拜爾斯眼科研究所和愛荷華大學(xué)卡弗醫(yī)學(xué)院Katherine J. Wert 和 Gabriel Velez教授課題組在 EBioMedicine(IF:8.143)發(fā)表了題為 “Metabolite therapy guided by liquid biopsy proteomics delays retinal neurodegeneration”的研究成果，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)、DESI-MSI空間代謝組學(xué)和LC-MS/MS等多組學(xué)研究方法，發(fā)現(xiàn)代謝途徑和能量通路對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)的保護(hù)作用特征，探究了補(bǔ)充代謝物保護(hù)視網(wǎng)膜機(jī)理，描繪了視網(wǎng)膜細(xì)胞通路中代謝物圖譜。為TCA循環(huán)和有氧代謝保護(hù)視網(wǎng)膜提供了理論依據(jù)。

研究思路

研究方法

1. 實(shí)驗(yàn)分組

（1）實(shí)驗(yàn)組：Pde6ɑ小鼠，食物中加入生酮、維生素B2和B3、ɑ-KG；飲用水中加入褪黑激素和白藜蘆醇

（2）對(duì)照組：C57BL/6J (B6)小鼠

2.技術(shù)路線

2.1AF/IR：獲取視網(wǎng)膜、視神經(jīng)的圖像

2.2免疫細(xì)胞化學(xué)：視網(wǎng)膜采用共焦顯微鏡成像

2.3蛋白質(zhì)組學(xué)：玻璃體和視網(wǎng)膜樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和消化

2.4 LC-MS/MS：分析SAX組分

2.5 DESI-MSI（空間代謝組學(xué)）：SAM（微陣列顯著性分析）技術(shù)區(qū)分Pde6ɑ小鼠和ɑ-KG治療小鼠

2.6統(tǒng)計(jì)分析：S-t 檢驗(yàn)、單因素方差分析、Tukey’s pos-hoc多重比

研究結(jié)果

蛋白質(zhì)組學(xué)研究RP的神經(jīng)視網(wǎng)膜變化

基因測(cè)試顯示PDE6A基因中存在p.R102C/p.S303C突變（圖1a）。與正常對(duì)照組相比（圖1b-d），眼底自體熒光（AF）顯示高密度中央AF環(huán)（圖1e-f），光學(xué)相干斷層掃描（OCT）顯示神經(jīng)元細(xì)胞層變薄（圖1g）。此外，AF成像上顯示高自體熒光環(huán)（圖1h-i），OCT成像顯示視網(wǎng)膜細(xì)胞層變薄和黃斑囊樣水腫（圖1j）。

圖1 | 兩名常染色體隱性遺傳性視網(wǎng)膜色素變性患者攜帶PDE6A突變

手術(shù)時(shí)收集液體玻璃體活組織，由于兩名arRP患者接受了玻璃體切除術(shù)以去除ERM，因此將兩名無(wú)RP患者的ERM玻璃體樣本用作對(duì)照（圖2a-b）。采用LC-MS/MS蛋白質(zhì)組學(xué)分析玻璃體樣品，以確定蛋白質(zhì)組含量。通過(guò)人玻璃體蛋白質(zhì)組學(xué)研究突出了RP疾病進(jìn)展過(guò)程中神經(jīng)視網(wǎng)膜的變化。

圖2 | PDE6A人玻璃體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

蛋白質(zhì)組學(xué)分析確臨床表型的蛋白表達(dá)改變

ERG分析，小鼠在一個(gè)月大時(shí)視桿光感受器視覺(jué)功能喪失，兩個(gè)月大時(shí)整體視覺(jué)功能完全喪失（圖3a）。Pde6ɑ小鼠出生后第14天組織學(xué)上可檢測(cè)到光感受器變性（圖3b）。采集患病小鼠的視網(wǎng)膜和玻璃體，并進(jìn)行LC-MS/MS蛋白組學(xué)分析。隨著神經(jīng)退行性變的發(fā)展，蛋白質(zhì)表達(dá)減少、蛋白質(zhì)的降解增加。通過(guò)野生型小鼠與Pde6ɑ小鼠玻璃體中的蛋白質(zhì)對(duì)比，表明神經(jīng)元細(xì)胞死亡是在早期階段。Pde6ɑ視網(wǎng)膜和玻璃體蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定了可能先于細(xì)胞丟失和RP臨床表型的整體蛋白表達(dá)的改變。

圖3 | 早期、中期和晚期視網(wǎng)膜色素變性（RP）患者Pde6ɑ視網(wǎng)膜和玻璃體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

氧化代謝途徑在神經(jīng)元細(xì)胞死亡開始時(shí)的Pde6ɑ視網(wǎng)膜

檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞死亡開始時(shí)的分化蛋白表達(dá)，使用單因素方差分析和分層熱圖聚類法比較PDE6ɑ（P15）和野生型小鼠的玻璃體和視網(wǎng)膜蛋白水平。與對(duì)照組相比，Pde6α中共有1067個(gè)蛋白差異表達(dá)D670G樣品。對(duì)照組視網(wǎng)膜中有446種蛋白在變性過(guò)程中缺失，并在病變的玻璃體Pde6ɑ中也被檢測(cè)到。表明在RP開始時(shí)，446種視網(wǎng)膜蛋白從健康視網(wǎng)膜中耗盡并釋放到玻璃體中（圖4）。

圖4 | Pde6ɑ視網(wǎng)膜和玻璃體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定整體蛋白表達(dá)變化

視網(wǎng)膜氧化代謝在早期視網(wǎng)膜變性中受到影響，表明視網(wǎng)膜神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可能對(duì)疾病期間發(fā)生的代謝途徑內(nèi)的變化敏感。而早期的Pde6ɑ小鼠蛋白質(zhì)組對(duì)候選生物標(biāo)記物的驗(yàn)證和鑒定表明了該治療方法的潛在靶向途徑（圖5）。

圖5 | 蛋白質(zhì)組學(xué)的arRP代謝物補(bǔ)充方法

生酮飲食延緩arRP小鼠光感受器細(xì)胞丟失

生酮飲食治療arRP小鼠，通過(guò)外核層厚度的組織學(xué)分析，其感光細(xì)胞的存活率較低（圖6a）。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)食物喂養(yǎng)的同窩小鼠相比，整體視覺(jué)反應(yīng)有輕微的緩解（圖6b），而小鼠的ERG反應(yīng)無(wú)顯著差異（圖6c-e）。

圖6 | 生酮飲食治療arRP臨床前小鼠光感受器細(xì)胞存活

口服補(bǔ)充單一代謝物可延長(zhǎng)神經(jīng)細(xì)胞存活和視力

Pde6ɑ小鼠的飲用水中提供α-酮戊二酸、維生素B3、維生素B2、褪黑素或白藜蘆醇，治療一個(gè)月后進(jìn)行ERG視覺(jué)功能檢查。ERG描記顯示，小鼠的視桿光感受器、視桿-視錐光感受器ɑ波反應(yīng)和全視網(wǎng)膜內(nèi)暗視ERG均出現(xiàn)視覺(jué)改善情況（圖7），而補(bǔ)充褪黑素和白藜蘆醇后均未顯示出對(duì)視覺(jué)功能的影響（圖7b-d）。通過(guò)ɑ-KG治療后，感光細(xì)胞（ONL）及其內(nèi)/外段在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著意義（圖7e-f）。評(píng)估GFAP免疫反應(yīng)性的分布，表明經(jīng)過(guò)一段時(shí)間治療，補(bǔ)充ɑ-KG不會(huì)抑制疾病模型中的Muller膠質(zhì)細(xì)胞激活（圖7g）。

圖7 | 口服補(bǔ)充單一代謝物可改善arRP臨床前小鼠的光感受器細(xì)胞存活和視覺(jué)功能

視網(wǎng)膜組織切片的空間代謝物/脂質(zhì)成像

為了研究Pde6α小鼠的脂質(zhì)和代謝物分布，選擇了35個(gè)新鮮冷凍組織樣本，并進(jìn)行負(fù)離子模式解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像（DESI-MSI）空間代謝組學(xué)研究（圖8a）。組織DESI-MS圖像質(zhì)譜表示，確定了分子離子是與糖酵解、TCA循環(huán)、脂肪酸和磷脂相關(guān)的小代謝物（圖8b-d）有關(guān)。微陣列顯著性分析（SAM）確定了未治療Pde6α和α-KG治療小鼠之間377種差異表達(dá)的代謝物有關(guān)。雖然DESI-MSI空間代謝組學(xué)檢測(cè)到了α-KG，但Pde6α和α-KG治療組之間的差異有限（圖8）。

圖8 | 視網(wǎng)膜組織切片的DESI-MSI

SAM中差異分布的代謝物表明，未經(jīng)治療的Pde6α和α-KG治療組之間的幾種改變途徑與蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果一致。根據(jù)DESI-MSI空間代謝組學(xué)成像和SAM，與未治療狀態(tài)相比，治療狀態(tài)下的琥珀酸、烏頭酸、谷氨酰胺水平均升高，谷氨酸水平略有增加（圖9a-d）。DESI-MSI表明補(bǔ)充的α-KG增加了TCA代謝物水平，可能在細(xì)胞的抗氧化反應(yīng)中發(fā)揮了一定的作用。

圖9 | DESI-MSI數(shù)據(jù)中野生型、arRP和α-KG治療小鼠的視網(wǎng)膜脂質(zhì)和代謝物相對(duì)強(qiáng)度分布

相關(guān)結(jié)論

蛋白質(zhì)組學(xué)和DESI-MSI空間代謝組學(xué)技術(shù)提供了關(guān)鍵途徑，而關(guān)鍵途徑內(nèi)的代謝產(chǎn)物傳遞顯示出對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的有效保護(hù)作用。蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)到的OXPHOS和TCA循環(huán)關(guān)鍵代謝途徑是相關(guān)色素性視網(wǎng)膜炎（RP）治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)，但也需要進(jìn)一步研究此方法是否適用于RP或其他神經(jīng)退行性疾病。

研究結(jié)論

通過(guò)液體活檢蛋白質(zhì)組學(xué)和DESI-MSI空間代謝組學(xué)方法分析色素性視網(wǎng)膜炎（RP）進(jìn)程中受影響的分子途徑靶點(diǎn)。通過(guò)口服補(bǔ)充循環(huán)代謝物，可保護(hù)神經(jīng)，增強(qiáng)視覺(jué)功能，延緩感光細(xì)胞的喪失，對(duì)感光細(xì)胞和內(nèi)視網(wǎng)膜均提供保護(hù)作用。

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