NBD C6-神經(jīng)酰胺（NBD C6-Ceramide，高爾基體熒光探針綠色)是一種熒光鞘脂類似物，可滲透細胞膜，是哺乳動物細胞高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜的重要染色劑。熒光 :λex 467 nm, λem 535 nm in methanol。

溶解度: Solubility DMF: 25 mg/ml DMF:PBS (pH 7.2) (1:1): 500 μg/ml DMSO: 10 mg/ml Ethanol: 5 mg/ml

性狀:Solid，power

儲藏條件:storage at -4℃ (1-2weeks), longer storage period at -20℃ (1-2years)

實驗步驟：

一、制備 NBD C6-Ceramide-BSA 復合物

對于活細胞或固定細胞的染色，使用添加 BSA 的 NBD C6-Ceramide-BSA 復合物能夠得到較好的染色效果。NBD C6-Ceramide-BSA 復合物制備方法如下：

1. 以氯仿：乙醇（體積比 19:1）為溶劑配制 1 mM NBD C6-Ceramide 溶液；

2. 吸取 50 μl NBD C6-Ceramide 溶液于小玻璃試管中，保持干燥，通入氮氣流，然后在真空狀態(tài)保持至少 1 小時，以 200 μl 無水乙醇重溶。

3. 量取 10 ml 無血清的平衡鹽溶液（如 HBSS 或 HEPES，pH 7.4）到 50 ml 塑料離心管中，加入 3.4 mg（使其濃度為 0.34 mg/ml）的脫脂 BSA。

4. 將含有 10 ml BSA 溶液的試管置于漩渦混合器上混勻，加入 200 μl NBD C6-Ceramide 溶液，漩渦震蕩混勻，所得溶液（5 μM NBD C6-Ceramide+5 μMBSA）保存于-20°C。

二、活細胞高爾基復合體染色

1. 用合適的緩沖液（如 HBSS/HEPES）沖洗蓋玻片上的細胞；

2. 加入 5 μM NBD C6-Ceramide+5 μM BSA 溶液于 4°C 孵育細胞 30 分鐘；

3. 用預冷的新鮮培養(yǎng)基反復沖洗細胞數(shù)次，37°C 孵育細胞 30 分鐘；

4. 用新鮮培養(yǎng)基沖洗細胞，熒光顯微鏡鏡檢。

三、經(jīng)過固定處理的細胞高爾基復合體染色

注意：染色條件同活細胞樣品，但應避免使用含甲醇/丙酮類的固定劑。

1. 用 HBSS/HEPES 緩沖液沖洗蓋玻片上的細胞，用 0.5%戊二醛/10%蔗糖/100 mM的 PIPES 緩沖液（pH 7.0）或者 2~4%多聚甲醛（溶于 PBS）溶液室溫下固定5~10 分鐘；

2. 用預冷的 HBSS/HEPES 反復沖洗細胞數(shù)次，加入 5 μM NBD C6-Ceramide+5 μMBSA 溶液于 4°C 冰浴孵育 30 分鐘；

3. 用 HBSS/HEPES 沖洗細胞樣品，以 10%的 FBS 或者 2 mg/ml 的 BSA 在室溫下孵育 30~90 分鐘，以加強高爾基體染色效果；

4. 用新鮮的 HBSS/HEPES 將細胞樣品沖洗干凈，熒光顯微鏡鏡檢。