牙周炎是一種普遍的慢性炎癥疾病，病情嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致牙齒脫落，嚴(yán)重影響口腔功能和患者的健康。目前的臨床治療方法可以限制疾病的進(jìn)展。雖然從無(wú)數(shù)成人組織中分離出來(lái)的干細(xì)胞的安全性和有效性已經(jīng)在人工牙周缺陷的動(dòng)物模型中得到驗(yàn)證，但它們?cè)谂R床上用于患者的再生目的基本上沒(méi)有達(dá)到預(yù)期效果。一個(gè)主要原因是，當(dāng)干細(xì)胞被應(yīng)用于牙周病變部位時(shí)，由于周圍的炎癥條件，它們無(wú)法發(fā)揮正常的多能性或再生潛力。

自噬是一個(gè)發(fā)生在所有真核細(xì)胞中的基礎(chǔ)水平的分解代謝過(guò)程﹐被公認(rèn)為參與了一系列的細(xì)胞事件，如細(xì)胞分化和生存。最近，自噬調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)一步被證明在炎癥、缺氧和營(yíng)養(yǎng)匱乏期間對(duì)維持細(xì)胞的生態(tài)平衡和生存至關(guān)重要。越來(lái)越多的證據(jù)表明，適當(dāng)?shù)淖允苫顒?dòng)是確保適當(dāng)?shù)募?xì)胞成骨分化的先決條件。盡管有研究已經(jīng)初步研究了PDLSCs的自噬活性如何在體外炎癥刺激下促進(jìn)其成骨分化，但與炎癥誘導(dǎo)的細(xì)胞變化相關(guān)的細(xì)胞自噬機(jī)制以及調(diào)節(jié)細(xì)胞成骨的自噬下游的決定因素在很大程度上仍然未知。

2022年8月14日，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院陳發(fā)明教授作為通訊作者在《Biomaterials》（IF=15.304）雜志上發(fā)表了題為“Gold nanoparticles targeting the autophagy–lysosome system to combat the inflammation-compromised osteogenic potential of periodontal ligament stem cells: From mechanism to therapy”的研究論文，揭示了炎癥影響下的自噬和細(xì)胞成骨的下游機(jī)制。值得注意的是本研究中使用到了漢恒生物的自噬雙標(biāo)腺病毒產(chǎn)品。

接下來(lái)，讓我們一起來(lái)了解一下這篇文章吧。

首先，作者將從捐贈(zèng)的人牙齒中分離和純化的PDLSCs細(xì)胞，在正常培養(yǎng)基和炎癥培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。并測(cè)試了自噬水平在炎癥條件下PDLSCs不同時(shí)間段自噬水平的變化情況。基于自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，在168小時(shí)內(nèi)測(cè)試了PDLSCs的自噬水平變化。作者發(fā)現(xiàn)，在炎癥條件下，PDLSCs的自噬在大約12或24小時(shí)內(nèi)被暫時(shí)激活。在炎癥刺激72小時(shí)后，自噬在PDLSCs中逐漸被抑制。為了避免短期（少于72小時(shí)）培養(yǎng)引起的瞬時(shí)自噬激活的干擾，并研究炎癥的相對(duì)長(zhǎng)期影響，作者在炎癥條件下預(yù)刺激PDLSCs（IPDLSCs） 7天，一個(gè)平行的7天正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照(PDLSCs)。PDLSCs和IPDLSCs的干細(xì)胞特征(在7天的預(yù)刺激期后)使用流式細(xì)胞儀、集落形成試驗(yàn)、以及其他方法（流式細(xì)胞儀、集落形成試驗(yàn)、CCK-8試驗(yàn)、脂肪生成和軟骨分化試驗(yàn)）進(jìn)行測(cè)量。兩個(gè)細(xì)胞系都表現(xiàn)出了形成細(xì)胞克隆的能力，雖然IPDLSCs形成的數(shù)量（第14天）明顯較低。PDLSCs和IPDLSCs都顯示了脂肪生成的多種分化潛力，或軟骨生成的多種分化潛力，在IPDLSCs成骨能力明顯低于PDLSCs。

圖1. 炎癥條件下培養(yǎng)PDLSCs會(huì)損傷其成骨潛力

接下來(lái)，為了研究PDLSCs在成骨分化過(guò)程中的自噬水平，根據(jù)PSLSCs和IPDLSCs中自噬相關(guān)蛋白（SQSTM1, LC3 II and BECN1）表達(dá)隨時(shí)間的變化情況，測(cè)量了成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞自噬激活的起始和停止時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬激活發(fā)生在PDLSCs成骨分化早期階段，這一點(diǎn)由LC3 II 和 BECN1的表達(dá)增多，SQSTM1的表達(dá)量減少所證實(shí)。IPDLSCs的自噬激活也顯示出類似的趨勢(shì)。在成骨分化過(guò)程中，自噬的激活也顯示出類似的趨勢(shì)；LC3 II的表達(dá)顯著增加，而SQSTM1的表達(dá)減少。在PDLSCs和IPDLSCs的細(xì)胞質(zhì)中都觀察到自噬體樣結(jié)構(gòu)。選擇了PDLSCs和IPDLSCs中自噬蛋白表達(dá)的比較，相較于PDLSCs， SQSTM1水平的增加、BECN1水平下降表明IPDLSCs自噬水平較低。然而，IPDLSCs在成骨誘導(dǎo)的6-24小時(shí)內(nèi)表達(dá)的LC3 II更多。作者又測(cè)量了PDLSCs和IPDLSCs的自噬通量。在成骨分化過(guò)程中，IPDLSCs在6小時(shí)和12小時(shí)內(nèi)表現(xiàn)出的自噬通量比PDLSCs低得多。在腺病毒mRFP-GFP-LC3實(shí)驗(yàn)中也觀察到類似的結(jié)果。

圖2. 炎癥條件下培養(yǎng)的PDLSCs在成骨誘導(dǎo)過(guò)程中表現(xiàn)出自噬水平的下降

基于IPDLSCs中自噬水平的下降和自噬通量的抑制，作者推測(cè)自噬溶酶體系統(tǒng)是PDLSCs的炎癥損害的限制因素。通過(guò)LC3、LAMP1的共定位來(lái)測(cè)量自噬體-溶酶體的融合，發(fā)現(xiàn)IPDLSCs的LC3和LAMP1的同聚程度比PDLSCs低得多，表明在成骨分化過(guò)程中，12小時(shí)內(nèi)LC3和LAMP1的共定位程度低于PDLSCs（P<0.01），IPDLSCs的自噬體-溶酶體融合受到影響。溶酶體的降解功能在IPDLSCs中被抑制了，IPDLSCs中的SQSTM1點(diǎn)的數(shù)量增加、SQSTM1點(diǎn)狀的積累減少證明了這一點(diǎn)。一個(gè)流暢的自噬過(guò)程和依賴溶酶體的降解是由一個(gè)主調(diào)控器（TFEB）和另一個(gè)主調(diào)控器的協(xié)調(diào)決定的。因此，作者還測(cè)量了TFEB的激活情況，結(jié)果TFEB在IPDLSCs細(xì)胞核中的表達(dá)減少，證實(shí)了TFEB在IPDLSCs中的激活受到抑制。此外，用qRT-PCR自噬相關(guān)的（MAP1LC3B，BECN1，和SQSTM1）和溶酶體相關(guān)基因（CTSB、HEXA和LAMP1）的表達(dá)。與PDLSCs相比，IPDLSCs表達(dá)較少的MAP1LC3B。這些結(jié)果表明，炎癥條件導(dǎo)致自噬-溶酶體系統(tǒng)的功能障礙，表現(xiàn)為自噬體和自溶體的融合受到抑制，溶酶體的功能受到損害，并抑制了TFEB的激活和表達(dá)。

圖3. 炎癥條件導(dǎo)致自噬-溶酶體系統(tǒng)的功能障礙

為了確定自噬-溶酶體系統(tǒng)在炎癥誘發(fā)的PDLSC成骨潛能損傷中的作用。作者在IPDLSCs中通過(guò)慢病毒過(guò)表達(dá)TFEB以激活細(xì)胞的自噬-溶酶體系統(tǒng)。在IPDLSCs中轉(zhuǎn)染LV對(duì)照組相比，在IPDLSCs中轉(zhuǎn)染LV-TFEB后，TFEB的表達(dá)水平從12%提高到了20%。在成骨誘導(dǎo)后12-72小時(shí)內(nèi)，TFEB的表達(dá)水平顯著提高。在IPDLSCs中TFEB的過(guò)表達(dá)明顯誘導(dǎo)了IPDLSCs的自噬激活。在成骨誘導(dǎo)后12和24小時(shí)內(nèi)，BECN1的增加、SQSTM1的減少表明了這一點(diǎn)。通過(guò)茜素紅S染色和Western blot分析，測(cè)量了TFEB過(guò)表達(dá)對(duì)IPDLSCs成骨潛能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TFEB在IPDLSCs中的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了IPDLSCs的成骨潛能，具體表現(xiàn)為在IPDLSCs中過(guò)量表達(dá)TFEB可以促進(jìn)IPDLSCs的成骨潛能，表現(xiàn)在Alizarin Red S染色的礦化結(jié)節(jié)的形成增加和成骨蛋白的表達(dá)量增加。

圖4. TFEB的過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)IPDLSCs的成骨潛能

最后，作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索了Au納米粒子處理IPDLSCs的濃度為0.01 nM。檢測(cè)了Au納米粒子處理IPDLSCs后對(duì)自噬和自噬通量的影響情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在成骨誘導(dǎo)的早期階段（6至72小時(shí)）Au納米粒子處理并沒(méi)有改變I-DLSCs中LC3 II的表達(dá)。然而，Au納米粒子處理增加了IPDLSCs的自噬通量，表現(xiàn)在LC3 II的積累明顯增加（與Baf處理相比，細(xì)胞中的LC3 II水平增加）。腺病毒mRFP-GFP-LC3也檢測(cè)到了一致的自噬通量變化趨勢(shì)。這些結(jié)果表明，經(jīng)Au納米粒子處理的IPDLSCs的自噬通量增加。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Au NP誘導(dǎo)IPDLSCs成骨潛能拯救自噬-溶酶體機(jī)制的作用，在成骨誘導(dǎo)的早期階段，作者分別使用siRNA-TFEB和3-MA來(lái)抑制Au納米粒子誘導(dǎo)的自噬激活的IPDLSCs，并評(píng)估IPDLSCs的自噬水平和成骨潛力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA-TFEB的應(yīng)用顯著抑制了TFEB的表達(dá)和Au納米粒子處理的自噬水平（由BECN1水平下降和SQSTM1水平上升確定）。此外，在Au納米粒子處理的敲除TFEB的IPDLSCs中抑制了Au納米粒子誘導(dǎo)后拯救的Alizarin Red S染色的鈣結(jié)節(jié)形成。3-MA處理也得到了一致的結(jié)果。

圖5. 敲除TFEB抑制了Au 納米粒子介導(dǎo)的自噬水平和對(duì)IPDLSCs的成骨潛力的拯救

總之，本研究首次在細(xì)胞器層面上揭示了炎癥損害的PDLSCs在細(xì)胞器水平上的機(jī)制，也證明了自噬-溶酶體系統(tǒng)在炎癥損害的PDLSCs成骨過(guò)程中的關(guān)鍵作用。并進(jìn)一步驗(yàn)證自噬-溶酶體系統(tǒng)參與了炎癥介導(dǎo)的自噬活性受損和隨后的PDLSCs成骨分化。同時(shí)，本研究結(jié)果也表明了Au納米粒子作為一種納米材料工具，可能是治療炎癥受損細(xì)胞的一條新途徑。