一、轉(zhuǎn)染流程

jetPrime

1.待細胞長到60%-80%時開始轉(zhuǎn)染。

2.先將Buffer和質(zhì)粒震蕩混勻。

3.加入轉(zhuǎn)染試劑（質(zhì)粒：轉(zhuǎn)染試劑=1：2，例如0.8μg質(zhì)粒加1.6μL的轉(zhuǎn)染試劑），震蕩混勻。

4.室溫靜置10min。

5.將混合物加入細胞中。

Lip3000

質(zhì)粒：p3000：lip3000=1：2：2，例如0.8μg質(zhì)粒加1.6μL的p3000，1.6μL的lip3000

1.待細胞長到60%-80%時開始轉(zhuǎn)染。

2.將質(zhì)粒和p3000（質(zhì)粒：p3000=1：2，例如0.8μg質(zhì)粒加1.6μL的p3000）加入Opti-MEM中，震蕩混勻，靜置5min。

3.將lip3000（質(zhì)粒：lip3000=1：2，例如0.8μg質(zhì)粒加1.6μL的lip3000）加入Opti-MEM中，震蕩混勻，靜置5min。

4.將上述兩管混合，渦旋震蕩混勻。

5.室溫靜置10-15min。

6.將混合物加入細胞中。

二、Co-IP

以HA-X和FLAG-Y為例

HA-X + - +

FLAG-Y - + +

1.中瓶細胞長滿之后鋪于小皿中，一個中瓶鋪6個小皿。

2.待細胞長到60%-80%時開始轉(zhuǎn)染，2個質(zhì)粒各轉(zhuǎn)4μg，總共轉(zhuǎn)8μg質(zhì)粒。

3.轉(zhuǎn)染步驟參考上文。

收樣

轉(zhuǎn)染后36-30h收樣

1.每個小皿加2mL預(yù)冷的PBS洗滌，棄盡。

2.加700μL裂解液，搖勻后冰上靜置3-5min，將細胞和裂解液轉(zhuǎn)移至新的1.5mLEp管中。

3.4℃，將Ep管放在搖轉(zhuǎn)儀上裂解30min。

4.4℃，10000rpm，離心10min，收集上清。

?吸取50μL上清加入5×loding buffer用于全細胞檢測。

?其余用于下一步。

5.上清中加入1.5μL一抗（單抗），4℃冰箱慢速旋轉(zhuǎn)過夜。

6.加入30μL充分重懸的protein A+G agarose，4℃冰箱旋轉(zhuǎn)裂解4-6h。

7.4℃，3000rpm離心5min，小心棄去上清，寧可殘存少量上清也勿吸到Agarose。

8.樣品中加入1mL裂解液，4℃冰箱快速旋轉(zhuǎn)洗滌珠子2次，每次洗滌8min。洗滌時離心條件和吸除上清要求同上步驟7.

完成最后一次洗滌之后，去除上清。把5×Loading buffer用裂解液配制成60μL 1×Loading buffer，加入Ep管中重懸珠子，煮樣，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>